呼吸病區(qū)碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的分子流行病學分析

姚欣，黎彧利

(重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401320)

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染的常見病原菌，常引起包括肺炎、敗血癥、尿路感染，傷口感染等多種醫(yī)院內(nèi)的感染。隨著抗生素的廣泛使用，眾多文獻報道耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來挑戰(zhàn)[1]。往往分離到耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的患者病情都較重，或在醫(yī)院內(nèi)住院時間較長，其分泌物、排泄物等可能成為污染源，如果醫(yī)護人員和病房消毒不徹底，極有可能通過醫(yī)護人員的手、醫(yī)療器械、圍簾等在院內(nèi)傳播[2]。該研究通過對呼吸病區(qū)病人標本、醫(yī)護人員手和護理單元圍簾分離到的耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌進行分子分型，研究其相關性和傳播途徑，為防止耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌在院內(nèi)傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

鮑曼不動桿菌分離自2017年7月—12月非重復株(同一患者只留取初次分離株)，全部菌株使用BDphoenix100全自動微生物鑒定藥敏儀進行菌種鑒定。

質(zhì)控菌株于2017年購于溫州康泰生物科技有限公司，此次實驗用到的質(zhì)控菌株包括ATCC25922、ATCC27853。

1.2 抗菌藥物敏感性試驗

使用BDphoenix100全自動微生物鑒定藥敏儀，MIC法測定10種抗菌藥物的敏感性。根據(jù)美國CLSI2017年標準進行藥敏判讀，把其中分離于呼吸病區(qū)分離的碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌作為本研究的實驗菌株。

1.3 隨機引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型

DNA制備：收集純培養(yǎng)菌落于Ep離心管，加入200ng/mL蛋白酶K200μL，充分混勻后37℃4小時，加入Chelex-100 40mL，15000r/min離心30s，取上清液作為擴增模版液。RAPD擴增總體積為25μL，包括4種dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，DNA模版0.5ng/μL，隨機引物(序列5'-TTATGTAAAACGACGGCCAGT-3')1.25μmol/L。PCR條件：94℃變性4min，94℃變性45s，36℃復性45s，72℃延伸2min，共40個循環(huán)，再72℃延伸5min。取擴增產(chǎn)物10μL以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外凝膠電泳儀觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.4 耐藥基因檢測

用PCR方法檢測blaTEM、blaVIM、IMP-1、IMP-2、OXA-23、OXA-24、Int1、Int2酶的編碼基因，各基因的擴增引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 23株碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物藥敏情況

23株鮑曼不動桿菌對哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、亞胺培南、美羅培南，除阿米卡星和黏菌素外其他抗菌藥物耐藥率均較高，12種抗菌藥物藥敏情況見表2。

2.2 隨機引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型結(jié)果

隨機引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型表明23株鮑曼不動桿菌中有1株細菌(5號菌株，圖1)不是同一克隆，其余細菌均來源于同一克隆株。17株病人標本來源鮑曼不動桿菌分布在呼吸科不同病房，經(jīng)醫(yī)院感染科2017年7—12月采樣，醫(yī)護人員手和病房圍簾分別檢出1株和3株鮑曼不動桿菌，且與18株病人標本檢出鮑曼不動桿菌有同源性，從而推斷呼吸科碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的爆發(fā)與醫(yī)護人員手衛(wèi)生和圍簾均有相關性。

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

表1 靶基因PCR引物序列

23株鮑曼不動桿菌中blaTEM、OXA-23、整合酶Int1的陽性率分別為95.7%、69.5%及82.6%，結(jié)果見表3。

3 討論

鮑曼不動桿菌是引起肺炎、重癥病人感染的重要病原菌，也是醫(yī)院感染的常見病原菌，醫(yī)院病人標本分離株常呈多重耐藥，且碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌越來越多見[3]。耐藥菌可以在特定的環(huán)境中引起傳播和流行，以致感染的發(fā)病率和病死率日益增加[4]。

碳青霉烯類抗生素是目前臨床抗菌活性最強大的抗生素之一。隨著該藥的廣泛使用，已出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌，導致感染流行成為全球關注的公共衛(wèi)生問題。本研究分析23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對常用抗生素的耐藥情況表明：氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑林、氯霉素、氨曲南、頭孢他啶、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、美羅培南12種抗生素耐藥率為100%，氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、復方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、亞胺培南耐藥率＞90%，阿米卡星耐藥率也高達76.3%，僅有黏菌素敏感率為100%。黏菌素作為近年來的新型抗生素還保持著對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的治療活性，作為治療碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的最后防線。

表2 23株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物敏感性

圖1 RAPD結(jié)果顯示5號與其他不同

表3 23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測結(jié)果

通過對23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌隨機引物多態(tài)性對其同源性分析發(fā)現(xiàn)：除一株來源于患者痰培養(yǎng)分離株外，其余22株為同一克隆株，其中有1株來源于醫(yī)護人員手，3株來源于病房圍簾，這表明碳氫霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌在2017年7月—12月期間在我院呼吸科流行，很有可能與醫(yī)護人員手衛(wèi)生以及病房環(huán)境相關，不排除還存在其他病房環(huán)境因素的風險可能。

文獻報道，鮑曼不動桿菌產(chǎn)生不同類型的β-內(nèi)酰胺酶成為β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，國內(nèi)從多重耐藥鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)了多種β-內(nèi)酰胺酶，最主要是質(zhì)粒介導的超廣譜β-內(nèi)胺酶(ESBLs)。本研究從23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌檢測blaTEM、blaVIM，結(jié)果blaTEM陽性率高達95.7%，鮑曼不動桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)胺酶合并外膜蛋白缺失、PBPs改變或主動外排機制，可能是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥嚴重的原因。

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制最主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶。不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要為B類金屬酶和D類苯唑西林酶。B類金屬酶，常見有blaIMP和blaVIM型β-內(nèi)酰胺酶；D類苯唑西林酶為OXA類酶。本研究23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌金屬酶IMP-1陽性率為26.1%(6/23)，OXA-23陽性率為69.5%(16/23)。可以看出我院鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥主要機制也是產(chǎn)D類苯唑西林酶，OXA-23可存在于質(zhì)粒或染色體上，通過可移動元件如轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒在不同菌株、不同個體之間傳播[5-6]，與國內(nèi)報道流行基因型為OXA-23一致[7]。

整合子是一個新的細菌耐藥基因水平傳播單元，是細菌獲得性耐藥的重要途徑，它是存在于質(zhì)粒和(或)染色體上的具有基因捕獲和表達功能的遺傳單位，介導耐藥基因水平傳播和轉(zhuǎn)移[8]。研究報道，整合子陽性的鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的總體耐藥率高達90%左右，而整合子陰性鮑曼不動桿菌的總體耐藥率僅為60%[9]。IntI1、IntI2、IntI3類整合酶是多重耐藥整合子。本研究中整合酶Int1陽性率高達82.6%(19/23)，說明我院多重耐藥鮑曼不動桿菌主要以I類整合子為主。

本研究顯示，我院碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌主要攜帶TEM廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因、產(chǎn)IMP-1金屬酶和OXA-23型碳青霉烯酶、I類整合子，產(chǎn)生OXA-23型碳青霉烯酶是主要耐藥機制。同期檢出的鮑曼不動桿菌有1株來源于醫(yī)護人員手，3株來源于病房圍簾，說明環(huán)境因素很可能與病人間鮑曼不動桿菌的流行相關[10]。有研究報道多重耐藥鮑曼不動桿菌在環(huán)境、醫(yī)務人員和患者之間傳播，我國也有發(fā)現(xiàn)同一克隆株的感染暴發(fā)[12-13]。有研究認為，優(yōu)勢克隆株在醫(yī)院的持續(xù)存在可能與該地區(qū)抗生素壓力有關，全基因組和比較基因組發(fā)現(xiàn)，即使屬于同一克隆，其質(zhì)粒、耐藥島等基因結(jié)構(gòu)也呈多變性，可能與不同壓力環(huán)境下活躍的基因組有關[15]。所以持續(xù)對同一地區(qū)的同一克隆株進行監(jiān)測，有助于了解其變化趨勢。

4 結(jié)論

加強醫(yī)護人員手衛(wèi)生是遏制醫(yī)院感染蔓延的有效途徑，特別是檢出多重耐藥菌感染或攜帶的患者床旁必須放置手消毒劑，加強手依從性監(jiān)督[11,14]。病房圍簾應定期清洗消毒后使用，同時提示病房床單、窗簾、床欄以及呼吸機、監(jiān)護儀等的清潔消毒與監(jiān)測都要定期完成，盡量減少醫(yī)院感染的發(fā)生，減少院內(nèi)微生物傳播的風險，特別是呼吸病區(qū)、重癥監(jiān)護室等易感區(qū)域。