基于星點設計-效應面法優化的紫薯花青素胃漂浮緩釋片的制備及評價標準

白明勇，周鑰，姜雪冰，程忠，吳逸凡，楊洪致，陳秋紅

(成都理工大學，成都 610051)

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類化合物，也是植物花瓣中主要的呈色物質。紫薯花青素作為一種天然食用色素，具有產量高，成本低，營養豐富，耐光性和耐熱性好等優點。大量研究表明，紫薯花青素具有降低血脂和抗氧化[1-2]，保護肝臟[3]，抗炎癥[4]，預防肥胖[5]，抑制金黃色葡萄球菌[6]和介導肝癌細胞SNU-387和結腸癌HCT－116細胞凋亡過程的抗癌等作用[7-10]。紫薯花青素在酸性環境下穩定，中性、堿性環境中易分解失效的理化性質使得紫薯花青素口服給藥后，在胃部穩定，轉運至腸道后，受到腸道中性環境的影響分解失效，較大地影響了其口服生物利用度，因此增加紫薯花青素在胃部的滯留時間以提高其口服生物利用度的新型制劑研究迫在眉睫；胃漂浮緩釋片可以使藥物一直處于胃部酸性環境中，同時減少給藥次數，提高紫薯花青素穩定性的同時提高了患者服藥的順應性。近年來，李飛[11]和王余夢[12]等研究了紫薯花青素微膠囊工藝，未見紫薯花青素胃漂浮緩釋片的文獻報道。本實驗以紫薯花青素為模型藥物，以羥丙甲基纖維素(HPMC)為主要輔材，采用濕法制粒壓片的方法制備胃漂浮緩釋片，減小生理環境對藥物穩定性的影響，延長花青素在胃內的滯留時間，以達到提高紫薯花青素口服生物利用度，減少給藥次數的目的。

1 材料與儀器

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司)；萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；TDP-6單沖壓片機(吉首市中誠制藥機械有限公司)；ZRS-8G智能藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司)。

1.2 試劑

花青素原料藥(西安優碩生物科技有限公司，批號：YS20180618)；羥丙甲基纖維素(HPMC K4M，Ashland)；乳糖(成都科龍化工試劑廠)；共聚維酮(上海昌為醫藥輔料技術有限公司)；碳酸氫鈉、硬脂酸鎂均為藥用規格；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 體外釋放度測定

2.1.1 標準曲線建立

精密稱取紫薯花青素提取物，以0.1mol/L鹽酸為溶劑，制備成濃度為6、12、30、60、100μg/mL的系列對照品溶液，于525nm波長處測定吸光度[13]，將吸光度值(A)對濃度(c)進行線性回歸，得回歸方程為 A=0.0015c－0.00452；r2=0.99997(見圖1)。結果表明，紫薯花青素在 6～100μg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.2 方法學考察

加樣回收實驗：取精密稱定后的紫薯花青素原料藥，以pH=1鹽酸溶液為溶劑，配制低(20μg/mL)、中(40μg/mL)、高(80μg/mL)濃度的紫薯花青素溶液，連續6次在525nm處測定吸光度，結果表明該法回收率良好(見表1)。

方法學考察表明，其精密度、重復性與穩定性實驗相對標準偏差(RSD)均符合相關要求。說明建立的分析方法可用于紫薯花青素的含量測定。

2.1.3 37℃(釋放實驗溫度)紫薯花青素的穩定性實驗

按加樣回收項下方法分別配置濃度為20μg/mL、40μg/mL、76μg/mL的紫薯花青素鹽酸溶液，在37±0.5℃保溫11h，定時取樣3mL，在525nm處測定吸收，根據標準曲線方程A=0.0015c－0.00452計算樣品濃度，結果見表2由結果可知，紫薯花青素鹽酸溶液在釋放試驗條件下11h內穩定。

2.1.4 釋放度測定方法

按《中華人民共和國藥典》2015年版(四部) 通則0931第一法(籃法)操作，以900mL的0.1mol/L鹽酸為釋放介質，轉速為100r/min，溫度(37.0±0.5)℃。在各規定測定時間取樣5mL(隨后補加同溫度下等體積介質)，0.45μm濾膜過濾，取續濾液于525nm處測定吸光度，計算累積釋放度。

圖1 紫薯花青素的標準曲線

2.2 制劑處方優化

2.2.1 紫薯花青素胃漂浮緩釋片的制備

該緩釋片采用濕法制粒壓片，具體制備方法為：按處方量稱取主藥與輔料，加入乳糖，混勻，以95%乙醇為潤濕劑，用24目藥典篩制粒，50℃干燥后整粒，加入潤滑劑硬脂酸鎂1%，混勻5min；壓片，得硬度(50±2)N，片重約300mg紫薯花青素胃漂浮緩釋片，每片含紫薯花青素30mg。

2.2.2 試驗設計

預試驗和單因素試驗考察結果顯示，制劑處方中HPMC K4M、共聚維酮與碳酸氫鈉的用量為藥物釋放和片劑漂浮性能的主要影響因素。各制劑處方胃漂浮性能良好，釋藥性能差別較大，選取制劑在1h、4h、8h的累積釋放度Q1h(20%～35%)、Q4h(40%～60%)、Q8h(85%～95%)為評價標準。星點設計-效應面法是近年來常用的實驗設計和優化方法，具有實驗精度高、擬合性好等特點[14]，按照星點設計－效應面法優化的原理設計了三因素五水平試驗，具體水平設置見表3，試驗安排及結果見表4。

2.2.3 紫薯花青素胃漂浮片漂浮性能

漂浮性能的測定采用直接觀察法。配制濃度為0.1mol/L的鹽酸900mL于溶出儀中，將制備好的片劑沿溶出杯同一高度劃入溶液表面，啟動攪拌槳(100 r/min)模擬胃蠕動溫度37℃，記錄起漂時間和持漂時間。從星點設計的結果來看，除處方1、3、8、9外，其余處方均迅速起漂，持漂時間均＞8h。

2.2.4 模型擬合實驗

應用 Design Expert 8.0.6.1 版軟件，分別進行多元線性回歸擬合和二元多項式擬合[15]。以置信度(P＜0.05)作為顯著標準，剔除不顯著項后選取復相關系數(r2)較大的模型，對其進行優化。

多元線性方程：

表1 紫薯花青素加樣回收實驗結果

表2 樣品溶液釋放度條件下的穩定性(n=5)

二項式擬合方程:

表3 星點設計因素水平表

表4 試驗安排及結果

比較多元線性擬合方程和二項式擬合方程的復相關系數，根據顯著性(P＜0.05)和r2最大原則，優選出二項式方程擬合效果更佳。經簡化后模型方程P＜0.05，r2＞0.7109，方程具有較高的可信度。星點設計-效應面法的擬合方程及方差分析表明，處方中HPMC K4M與共聚維酮用量對藥物釋放有極顯著影響，碳酸氫鈉用量對藥物釋放的影響不顯著,藥片主要由于碳酸氫鈉與胃內酸性介質反應持續產生氣體而快速且持續漂浮在胃內，實驗得出碳酸氫鈉的用量是影響漂浮性能的主要因素。

2.2.5 效應面

根據簡化后的二項式擬合方程，分別以累積釋放度Q1h、Q4h、Q8h對A(HPMC)，B(碳酸氫鈉)，C(共聚維酮)做三維效應面圖和等高線圖(見圖2)。從三維效應面圖和等高線圖可看出，藥物累積釋放度隨 HPMC K4M和共聚維酮用量的增加而降低，共聚維酮用量對藥物釋放的影響比HPMC K4M用量更顯著，三因素中對本制劑體外釋藥影響大小為共聚維酮＞HPMC＞碳酸氫鈉。

2.2.6 優化處方

經模型擬合，將效應面對應的等高線疊加，得到輔料用量預測最佳范圍為:HPMC 17.46%～26.94%、碳酸氫鈉9.62%～15.13%。優化處方的等高線疊加圖(圖3)。根據 Design-Expert軟件優選出最佳處方:HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%。

圖2 Q1h、Q4h、Q8h 對HPMC和共聚維酮的三維效應面圖和等高線圖

2.2.7 釋放度測定

按照最佳處方：HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%，平行制備三批紫薯花青素胃漂浮緩釋片，每批投藥量為6片，所制備的胃漂浮緩釋片的起漂時間＜5min，續漂時間＞11h，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h的累積釋放度RSD分別為0.86%、4.11%、7.34%、1.39%、3.39%、1.64%、2.67%、0.76%、0.55%、1.18%、1.10%各批次取樣點平均累計釋放度和RSD值見表5，重復性良好，符合設計要求。其中1h，4h，8h累積釋放度的預測值和實測值見表6，預測值和實測值偏差絕對值均小于5%，表明實驗所得擬合方程能很好的預測實驗結果和趨勢。

2.2.8 釋藥機理初步研究

圖3 處方優化等高線疊加圖

表5 各批次取樣點平均累計釋放度和RSD值(n=6)

按最佳制劑處方制備紫薯花青素胃漂浮緩釋片，三批樣品體外釋放曲線見圖4。應用Origin 2016軟件對其體外釋放曲線進行方程擬合，分別采用了零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程、Weibull方程和Ritger-peppas方程等進行擬合，擬合結果見表7。其體外釋放行為，以Weibull方程擬合效果最好，Weibull擬合曲線見表5。擬合方程結果可以看出藥物為非 Fick 擴散，通過擴散和骨架溶蝕共同作用釋藥[16]。在釋放試驗中，HPMC吸水形成凝膠，藥片體積逐漸增大，藥物透過凝膠骨架空隙緩慢擴散，釋藥后期以骨架溶蝕為主，同時可以得出藥物釋放符合一級速率過程，釋放曲線具有明顯的緩釋特征。體外釋放度試驗顯示，制備的紫薯花青素胃漂浮緩釋片達到11h緩釋。

3 討論與展望

普通片劑在胃腸道滯留時間太短，未被釋放就通過吸收部位，胃漂浮片是根據流體動力學平衡原理制成的一種新型制劑，這種制劑在胃中滯留時間長，將紫薯花青素制成胃漂浮緩釋片有助于提高紫薯花青素的口服生物利用度。

不同黏度的HPMC 對藥物釋放度影響較大，在實驗前期考察了不同黏度的HPMC(K4M、K15M)對藥物體外釋放度的影響，實驗結果顯示HPMC K15M黏度過大，藥物釋放過于緩慢，黏度較低的HPMC K4M更符合本實驗對胃漂浮緩釋片的要求，因此本實驗選擇了HPMC K4M為凝膠骨架。

根據星點設計試驗處方1、3、9結果，可以認為凝膠骨架HPMC的用量對于藥物突釋有較大影響，用量過少會導致藥物突釋；根據處方15，16結果，可以認為共聚維酮對藥物釋放同樣有較大影響，過多會造成藥物釋放過緩，過少會造成藥物突釋。

表6 驗證處方的累積釋放度

圖4 優化處方的體外釋放曲線(n=6)

本實驗為胃漂浮緩釋片應用于更多種類的花青素的實際應用提供了指導，但因時間有限，本實驗僅對紫薯花青素胃漂浮緩釋片體外釋放度進行了研究，而未對紫薯花青素胃漂浮緩釋片進行體內漂浮性能及釋藥特性進行研究，在將來的研究中將更全面的研究其漂浮性能和釋藥特性。

藥物穩定性是保障藥物安全性和有效性的基本條件，本實驗還未對紫薯花青素胃漂浮緩釋片進行影響因素、加速實驗以及長期穩定性方面的實驗，后續應考察該制劑在溫度、濕度以及光照的影響下隨時間變化的規律，為藥品的生產、包裝、貯存及運輸條件提供科學依據。

表7 最佳處方體外釋放度擬合方程

圖5 Weibull擬合曲線

本文通過星點設計-效應面法設計安排試驗并對結果進行擬合分析，建立了共聚維酮、HPMC K4M和碳酸氫鈉用量與胃漂浮緩釋片釋藥特性的二次模型，得到最佳處方:HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%、乳糖 49.46%,整粒后加入硬脂酸鎂1%，經試驗驗證，最優處方制得胃漂浮緩釋片持漂時間＞11h，11h累積釋放度達到95%以上，具有良好的漂浮性能，制備方法簡便，工藝穩定。星點設計-效應面法可以很好的用于紫薯花青素胃漂浮緩釋片處方工藝優化，具有很好的應用價值。