具有優秀抗腫瘤活性的香豆素雜合體

(浙江仙居君業藥業有限公司,仙居 317300)

1 前言

眾所周知，自然界蘊藏著豐富的藥物資源，是新藥的重要來源，如80%的抗腫瘤藥物源自天然產物及其衍生物[1-2]。香豆素(圖1,2H-1-苯并吡喃-2-酮)結構片段廣泛存在于天然產物中，其衍生物可通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)、端粒酶、蛋白激酶、硫酸酯酶、碳酸酐酶、芳香化酶、微管蛋白和單羧酸轉運蛋白等誘導腫瘤細胞凋亡，對包括耐多藥腫瘤細胞在內的多種腫瘤細胞具有良好的活性[3-5]。特別值得一提的是，香豆素衍生物Irosustat(STX64,BN83495)可阻止雌激素的分泌，具有良好的抗乳腺癌活性[6-7]。目前，本品正處于臨床評價階段，有望于不久的將來為人類健康服務。由此可見，香豆素類化合物在抗腫瘤新藥研發領域占據重要位置。

本文將著重介紹自2015年以來所發現的具有優秀體內外抗腫瘤活性(半抑制濃度或50%生長抑制所需的藥物濃度＜10μmol/L或具有潛在體內活性)的香豆素雜合體(包括香豆素-查耳酮、香豆素-唑、香豆素-吲哚/喹啉和香豆素-氧化呋咱等雜合體)的研究進展，并總結了構-效關系(SAR)和作用機制，為進一步研究提供理論支持。

圖1 香豆素母核和Irosustat的化學結構

2 香豆素-查耳酮雜合體

香豆素-查耳酮雜合體1(圖2,IC50:0.65～2.02μmol/L)的抗K562和HepG2腫瘤細胞活性優于對照藥阿霉素、卡貝塔汀和順鉑(IC50:2.02～4.93μmol/L)[8]。作用機制研究結果表明，這類雜合體可激活半胱天冬酶-3和-9、提升促凋亡蛋白Bax水平和降低B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)水平，阻滯腫瘤細胞G2/M期，誘導細胞凋亡。其中，代表物1a(IC50:0.65和1.09μmol/L)不僅抗K562和HepG2腫瘤細胞活性最高，而且對正常WI-38細胞的毒性(IC50:292.7μmol/L)極低，選擇性指數268。總之，良好的活性和安全性使得該雜合體極具進一步研發前景。

進一步研究發現，向香豆素母核的7號位引入二乙胺基所得的雜合體2a,b(IC50:3.60和3.91μmol/L)也具有良好的抗HCT-116細胞活性，其活性是黃腐酚(IC50:27.60μmol/L)的8倍左右[9]。作用機制研究結果表明，雜合體2a可促使活性氧(ROS)的產生激活線粒體凋亡途徑，進而抑制腫瘤細胞轉移和破壞集落形成能力，進而誘導腫瘤細胞凋亡。

香豆素-查耳酮雜合體3a(IC50:2.32μmol/L)的抗HepG2細胞活性是對照藥索拉非尼(IC50:7.52μmol/L)的3.2倍，而化合物3b(IC50:1.62μmol/L)的抗H4IIE細胞活性則是索拉非尼(3.45μmol/L)的2.1倍[10]。作用機制研究結果表明，雜合體3a可阻滯H4IIE細胞的S期，進而發揮抗腫瘤活性。

香豆素-查耳酮雜合體4可通過與腫瘤細胞DNA的小溝結合解鏈DNA，導致腫瘤細胞死亡[11]。在移植人宮頸癌細胞的小鼠模型中，該雜合體不僅可顯著減小腫瘤體積，活性與阿霉素相當，而且未見明顯的毒副作用，小鼠的存活率與阿霉素相當。顯然，該雜合體極具進一步研究價值。

3 香豆素-唑雜合體

香豆素-1,2,3-三氮唑雜合體5a～c(圖3,IC50:0.13～6.25μmol/L)具有潛在的抗PC3,MGC803和HepG2腫瘤細胞活性，其中，代表物5c(IC50:0.43,0.13和1.74μmol/L)的活性優于對照藥秋水仙堿(IC50:0.59,0.27和4.60μmol/L)[12]。作用機制研究結果表明，雜合體5c不僅可通過與秋水仙堿位點結合抑制微管蛋白聚合，而且可抑制細胞集落形成，阻滯G2/M期，誘導MGC803細胞凋亡。香豆素-噻唑-1,2,4-三氮唑-3-酮雜合體6(IC50:160～1120nmol/L)具有優秀的抗A549、MDA-MBA-231、HeLa和K562腫瘤細胞活性，且SAR顯示，向R1和R2位引入供電子基尤其是甲氧基對活性有利，而鹵素對活性不利[13]。代表物6a(IC50:160～310nmol/L)對所測4株腫瘤細胞的活性是對照藥阿霉素(IC50:540～600nmol/L)的1.9～3.3倍，可作為先導物進一步研究。

香豆素-吡唑雜合體7(IC50:2.08～5.36μmol/L)的抗HepG2、SMMC-7721、U87和H1299腫瘤細胞活性與阿霉素(IC50:2.32～4.28μmol/L)相當，是5-氟尿嘧啶(IC50:31.7～45.3μmol/L)的7.8～18.1倍[14]。在移植SMMC-7721細胞的小鼠模型中，該雜合體在給藥劑量為30和60mg/kg時可分別降低55.3%和68.3%的腫瘤質量，且在連續給藥14d，給藥劑量為300mg/kg時未見急性毒性和小鼠死亡，提示該雜合體安全性良好。基于此，該合體極具進一步研究價值。雜合體8 (IC50:0.36～2.56μmol/L)的抗HeLa、HepG2、F10和A549腫瘤細胞活性是對照藥塞來考昔(IC50:7.79～15.64μmol/L)的6.1～21.6倍，且作用機制研究結果表明，該雜合體可顯著地抑制腫瘤細胞黏附、遷移和侵襲，進而阻止腫瘤細胞轉移[15-16]。

圖2 香豆素-查耳酮雜合體1～4的化學結構

香豆素-吡唑啉雜合體9a～e(IC50:10～18nmol/L)的抗HepG2細胞活性是阿霉素(IC50:630nmol/L)的35～63倍，且SAR顯示，向R2位引入噻吩-2-基比苯環對活性更有利[17]。進一步研究發現，在濃度為10nmol/L時，雜合體9f～i對源自白血病、肺癌、結腸癌、中樞神經系統、黑素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌的60種人腫瘤細胞具有極為優秀的廣譜活性，平均抑制率為77.59%～98.35%[18-20]。顯然，這類雜合體值得進一步研究。

圖3 香豆素-唑雜合體5～21的化學結構

香豆素-噻唑雜合體10(IC50:11.4～15.6μmol/L)盡管僅具有中等強度的體外抗EAC和DLA腫瘤細胞活性，但該化合物(75mg/kg,腹腔注射)在小鼠體內可抑制76%的腫瘤細胞生長，且可將小鼠的存活時間由11d延長到34d[21]。雜合體11(IC50:9.1～568.9 nmol/L)的抗HeLa細胞活性優于阿霉素(IC50:1107 nmol/L)，且SAR顯示乙酯遠優于甲酯[22]。作用機制研究結果表明，這類雜合體可激活半胱天冬酶-3和-9，阻滯腫瘤細胞的G0/G1期，誘導腫瘤細胞凋亡。香豆素-吡唑啉-噻唑雜合體12a～c不僅抗MCF-7細胞活性(IC50:5.41～6.56μmol/L)略優于阿霉素(IC50:6.73μmol/L)，而且對正常HFB4細胞的毒性(IC50:113～128μmol/L)與阿霉素(IC50:163μmol/L)相當[23]。三者(IC50:34～582nmol/L)對血管內皮生長因子受體2 (VEGFR-2)具有良好的抑制活性，但略弱于索拉非尼(IC50:19 nmol/L)。代表物12c可激活MCF-7細胞半胱天冬酶-7和-9，阻滯G2/M期，誘導MCF-7細胞凋亡。香豆素-吡唑-噻唑雜合體13(IC50:3.06～3.74μmol/L)的抗HepG2細胞活性與對照藥阿霉素(IC50:3.01μmol/L)相當，可作為先導物進一步優化[24]。

香豆素-噻唑雜合體14a,b(IC50:1.29～1.96μmol/L)的體外抗HeLa和COS-7腫瘤細胞活性優于對照藥阿霉素(IC50:2.05和3.04μmol/L)[25]。在EAC移植小鼠模型中，二者(39.3和45.5d)與安慰劑組(14.5d)相比可顯著地延長小鼠的壽命，但略弱于5-氟尿嘧啶(49.0d)。此外，雜合體14b還可顯著地降低小鼠體內腫瘤細胞數目和腫瘤體積，值得深入研究。雜合體15(IC50:3.48μmol/L)的抗Caco-2細胞和16(IC50:5.03μmol/L)的HepG2細胞活性與阿霉素(IC50:4.10和5.43 μmol/L)相當，且二者可提高半胱天冬酶-3和Bax表達，降低Bcl-2表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡[26]。

香豆素-苯并噻唑雜合體17(IC50:240和330nmol/L)具有極高的抗SNB-75和OVCAR-4腫瘤細胞活性，可作為先導物進一步研究[27]。香豆素-苯并噻唑釕絡合物18(IC50:0.30～68.69μmol/L)不僅具有抗NCI-H460,T-24,SKOV-3,MGC80-3和A549腫瘤細胞活性，而且對正常HL-7702細胞未顯示出任何毒性(IC50:＞100μmol/L)[28]。在NCI-H460抑制的小鼠模型中，該絡合物18(10.0mg/kg)可抑制61.3%的腫瘤細胞，活性優于順鉑(抑制率:25.5%)。不僅如此，該絡合物未顯示出明顯的體內毒性，故可作為先導物進一步研究。香豆素-噻唑-2,4-二酮雜合體19(IC50:0.95～3.20μmol/L)的抗MCF-7,HeLa和A549腫瘤細胞活性與阿霉素(IC50:0.82～2.13μmol/L)相當，值得進一步優化[29]。

香豆素-苯并咪唑雜合體20 a～d(GI50:0.07～3.57μmol/L)具有廣譜抗AGS、KATO-III、SNU-1、SKOV3、OVCAR-8、BXPC-3、PANC-1、T24、WiDr、HepG2、SN12C和K562腫瘤細胞活性，且代表物20a(GI50:70～410nmol/L)的GI50在納摩爾級[30]。作用機制研究結果表明，雜合體20a可通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路誘導腫瘤細胞凋亡。進一步研究發現，雜合體20e(GI50:50～80nmol/L)的抗MCF-7,NCI-H460和SF-268腫瘤細胞活性是對照藥阿霉素 (GI50:40～90nmol/L)的1.5～2.0倍，值得進一步研究[31-32]。

香豆素-異噁唑啉雜合體21(IC50:10.5μmol/L)雖然僅具有中等強度的抗UACC 903細胞活性，但對正常FF2441細胞未顯示出任何毒性(IC50:＞100μmol/L)[33]。在小鼠體內模型中，該雜合體不僅可在給藥劑量為100mg/kg時減小85%的腫瘤體積，而且與對照組相比，可大幅延長小鼠壽命。

4 香豆素-吲哚/喹啉雜合體

香豆素-吲哚雜合體22 (圖4,GI50:0.33～3.96μmol/L)和23(GI50:2.64～5.38μmol/L)對源自白血病、肺癌、結腸癌、中樞神經系統、黑素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌的60種人腫瘤細胞具有優秀的廣譜活性，可作為先導物進一步優化[34-35]。雜合體24a,b(IC50:7.4和5.5μmol/L)和25(IC50:9.1μmol/L)具有潛在的抗MCF-7細胞活性，但弱于對照藥長春新堿(IC50:0.3μmol/L)[36-37]。其中，雜合體24a(IC50:＞100μmol/L)不僅對正常VERO細胞未顯示出任何毒性，而且可通過阻滯腫瘤細胞G2/M期誘導細胞凋亡。

香豆素-喹啉雜合體26(IC50:5.45～9.41μmol/L)的抗PANC-1,HepG2和CCRF腫瘤細胞活性與阿霉素(IC50:1.05～6.90μmol/L)處于同一級別，可作為先導物進一步優化[38]。作用機制研究結果表明，該雜合體可通過激活半胱天冬酶-3和-7，抑制腫瘤細胞代謝，誘導細胞凋亡。雜合體27a,b(IC50:42和102nmol/L)的不僅抗A2780腫瘤活性是阿霉素(IC50:6.1μmol/L)的145.2和59.8倍，而且對正常PC12細胞無毒(IC50:＞100μmol/L)[39]。作用機制研究結果表明，該雜合體可激活半胱天冬酶-3和-9，提升Bcl-2和凋亡抑制蛋白survivin表達水平，促使ROS生成，進而導致 A2780細胞凋亡。

圖4 香豆素-吲哚/喹啉雜合體22～28的化學結構

香豆素-喹啉鉑絡合物28(IC50:0.10～75.25μmol/L)對藥敏型A549、SK-OV-3、HeLa、NCI-H460和耐順鉑型A549/DDP、SK-OV-3/DDP腫瘤細胞均敏感，且耐藥性指數＜1，提示這類化合物具有治療耐藥腫瘤的潛力[40]。在HeLa抑制小鼠模型中，該絡合物(2日,2.0 mg/kg)可抑制37.2%的腫瘤生長，活性優于順鉑(2日,2.0mg/kg,抑制率為35.2%)。不僅如此，絡合物28組未見小鼠死亡或體重降低，表明其體內安全性良好。顯然，該化合物極具進一步研究價值。

5 香豆素-氧化呋咱雜合體

香豆素-氧化呋咱雜合體29(圖5)具有極為優秀的抗藥敏型(HeLa、SKOV3、A549、OVCA429,OVCA433、A2780、MDA-MB-231、MCF-7、KB,MV-4-11和MM-1S)和耐藥型(耐順鉑A2780/CDDP,耐吉西他濱MDA-MB-231/Gem,耐阿霉素MCF-7/ADR和耐長春新堿KB-V)腫瘤細胞活性，IC50分別為20.9～445nmol/L和24.9～156.8nmol/L[41-42]。作用機制研究結果表明，雜合體29可干擾MEK1和ERK1磷酸化，阻滯A2780細胞G2/M期，進而導致腫瘤細胞凋亡。在A2780移植小鼠模型中，與對照組相比，該雜合體在給藥劑量為15和30mg/kg時可抑制55.8%和65.5%的腫瘤生長，且未見小鼠體重減輕。對藥敏型和耐藥型腫瘤細胞優秀的體內外活性加之良好的安全性，使得該雜合體極具進一步研究價值。

進一步修飾所得的雜合體30 (IC50:0.8～4542nmol/L和5.1～94.0nmol/L)和31(IC50:0.5～2182nmol/L和10.1～93.0nmol/L)對所測藥敏型(HeLa、SKOV3、A549、OVCA429、OVCA433、A2780、MDA-MB-231、MCF-7、KB、MV-4-11和MM-1S)和耐藥型(耐順鉑A2780/CDDP,耐吉西他濱MDA-MB-231/Gem,耐阿霉素MCF-7/ADR和耐長春新堿KB-V)腫瘤細胞也具有極為優秀的活性[43-44]。其中，代表物30a對所測腫瘤細胞的IC50更是低至0.5～143nmol/L，值得進一步研究。

6 其它香豆素雜合體

香豆素-吡啶雜合體32 a～c(圖6,IC50:1.11～9.33μmol/L)的抗MCF-7、HCT-116、HepG2和A549腫瘤細胞活性與5-氟尿嘧啶(IC50:7.65～8.78μmol/L)相當或更優[45]。作用機制研究結果表明，此類雜合體可阻滯腫瘤細胞的G2/M期，誘導腫瘤細胞凋亡。雜合體33(IC50:1.66～9.27μmol/L)具有潛在的抗K562、HeLa、A549和MCF-7腫瘤細胞活性，且這類化合物可通過磷酸化Akt誘導細胞凋亡。代表物33a(IC50:1.66～7.86μmol/L)的活性與對照藥BENC-511(IC50:0.95～6.43μmol/L)相當，但遠弱于紫杉醇(IC50:0.0033～0.014μmol/L)[46]。

圖5 香豆素-氧化呋咱雜合體29～31的化學結構

圖6 香豆素雜合體32～36的化學結構

雜合體34(IC50:5.92～7.45μmol/L)具有潛在的抗HepG2,SK-Hep1和MCF-7腫瘤細胞活性，且抗SKHep1和MCF-7腫瘤細胞活性與順鉑相當[47]。作用機制研究結果表明，該雜合體可抑制HepG2細胞集落形成、侵入和轉移，提高ROS水平，阻滯G2/M期，誘導腫瘤細胞凋亡。

雜合體35(IC50:2.53 μmol/L)不僅抗MCF-7細胞活性是對照藥甲氨蝶呤(IC50:27.09μmol/L)的10.7倍，而且對正常BHK細胞的毒性極低(IC50:149.88μmol/L)，選擇性指數為59.2[48]。雜合體36(IC50:4.63～7.02μmol/L)也具有潛在的抗A549、HepG2、PANC-1和SGC-7901腫瘤細胞活性，可作為先導物進一步優化[49]。

7 結束語

香豆素雜合體可通過多種作用機制發揮抗腫瘤活性，對包括耐藥腫瘤細胞在內的多種腫瘤細胞具有良好的抑制活性。多個香豆素雜合體的體外抗腫瘤活性在納摩爾級，體內活性優于對照藥，且無明顯毒副作用。顯然，這類化合物在抗腫瘤新藥研發領域必將大有作為。

本文綜述了近年來所發現的具有優秀體內外抗腫瘤活性的香豆素-查耳酮、香豆素-唑、香豆素-吲哚/喹啉和香豆素-氧化呋咱等雜合體的最新研究進展，并總結了SAR和作用機制，為進一步研究提供理論支持。