宮頸病變患者陰道菌群種類構(gòu)成分布及意義*

（綿陽市人民醫(yī)院 婦科，四川 綿陽 621000）

宮頸癌是威脅全球女性健康的最大疾病之一，宮頸癌患者的發(fā)病率與病死率居高不下[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變是在臨床中并未確診為原位癌的宮頸異常增殖性病變，其長期存在可能發(fā)展為宮頸癌[2-3]。宮頸上皮內(nèi)瘤變暴露在陰道微環(huán)境內(nèi)，而陰道微環(huán)境中的菌群具有保護陰道微環(huán)境的作用。目前對陰道菌群在宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用仍有爭論。本研究重點探討宮頸上皮內(nèi)瘤變患者陰道菌群分布情況，對指導(dǎo)臨床宮頸病變篩查與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2019年1月在綿陽市人民醫(yī)院婦科就診的180 例宮頸病變患者，分為宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）I級88 例（CIN I組）和CIN Ⅱ/Ⅲ級92 例（CIN Ⅱ/Ⅲ組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)與宮頸活檢病理確診為CIN I級和/或Ⅱ/Ⅲ級；②年齡22 ～60 歲；③性生活≥3年，但近3 d 內(nèi)無性生活史；④自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫缺陷、全身系統(tǒng)性疾病；②糖尿病、激素治療性疾病；③月經(jīng)不規(guī)律；④近1 周內(nèi)見異常陰道分泌物及陰道流血；⑤婦科檢查患有細(xì)菌性陰道病、毛滴蟲陰道炎及外陰陰道假絲酵母菌病。選取同期本院體檢的健康女性75 例作為對照組。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

DNA 試劑盒（德國Qiagen 公司），細(xì)菌培養(yǎng)基（廣州市珠海迪爾生物工程有限公司）。ABI-2720 PCR儀（美國ABI 公司），Illumina Miseq 測序平臺（美國MiSeq 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集采用無菌棉拭子深入陰道后選取后穹隆位置緩慢轉(zhuǎn)動10 ～15 s 后，待棉拭子充分吸收分泌物后取出，置入干燥無菌試管中。標(biāo)本采集后存放于-80℃冰箱，用于細(xì)菌基因組DNA 的提取。

1.3.2 細(xì)菌基因總DNA 提取參考文獻[4]采用DNA 試劑盒提取樣本中總DNA，按照說明書進行操作，成功提取DNA 后存放于-20℃冰箱中。

1.3.3 16S rRNA V3、V4 區(qū)的PCR 擴增與IlluminaMiseq測序參考文獻[5]引物對照，采用PCR 擴增法（北京線上生物科技有限公司）將基因組DNA 稀釋并進行提取后，進一步使16S rRNA 的V3、V4 區(qū)基因片段系數(shù)放大，同時采用雙末端展開序列測試。具體采用的引物片段參考文獻[6]。正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，長 度338 bp；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，長度806 bp。經(jīng)PCR 反應(yīng)后，取得緩沖液5×FastPfu 4μl，構(gòu)成成分包含dNTPs 2.0μ1，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4μl，正反向引物各0.8μl，模板0.5μl，無菌去離子水11.5μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共計27 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min，儲存于4℃環(huán)境中，將PCR 產(chǎn)物等量混合后檢測樣本標(biāo)簽序列，由上海派森諾醫(yī)學(xué)檢驗所完成。革蘭染色檢測乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬。采用培養(yǎng)法進行厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門鑒定。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察各組Alpha 多樣性指數(shù)評估（菌種豐度指數(shù)Chao、ACE）、菌種多樣性指數(shù)（Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)）、微生物群菌落門及微菌群分布情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步兩兩比較用χ2分割法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Alpha 多樣性變化

對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而Chao、ACE 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CIN I組較對照組、CIN Ⅱ/Ⅲ組高（P＜0.05），且CIN Ⅱ/Ⅲ組高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組菌門結(jié)構(gòu)

本研究總共測出23 個菌門，對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=40 176.180，P=0.000）。對照組與CIN I組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15 894.568，P=0.000）；對照組與CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=28 239.622，P=0.000）；CIN I組與CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25 889.547，P=0.000）。見表2。

2.3 各組菌群類型

對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=79 286.753，P=0.000）。對照組與CIN I組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=188 665.755，P=0.000）；對照組與CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14 952.312，P=0.000）；CIN I組與CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=28 097.984，P=0.000）。見表3。

表1 各組Alpha 多樣性變化比較 （±s）

表1 各組Alpha 多樣性變化比較 （±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

組別 n Chao ACE Simpson 指數(shù) Shannon 指數(shù)對照組 75 47.54±23.14 53.02±24.17 0.69±0.18 0.70±0.58 CIN I組 88 65.02±24.51? 84.14±27.01? 0.55±0.22 1.02±0.71 CIN Ⅱ/Ⅲ組 92 60.02±29.27? 71.02±28.02? 0.78±0.21 0.69±0.68 F 值 10.290 27.790 1.630 0.101 P 值 0.001 0.001 0.105 0.920

表2 各組菌門結(jié)構(gòu)比較

表3 各組菌群類型比較

3 討論

宮頸癌是現(xiàn)階段病因明確的惡性婦科腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染有一定關(guān)系，但其進展為宮頸癌的潛伏期長，所以在潛伏期臨床及早發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)。目前，臨床對宮頸病變進展的因素尚未統(tǒng)一，但有研究發(fā)現(xiàn)，陰道菌群結(jié)構(gòu)改變與宮頸病變相關(guān)[7]。

國內(nèi)外相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，女性陰道微環(huán)境菌群構(gòu)成具有一定的規(guī)律性，但其不穩(wěn)定的變化發(fā)展與宮頸病變表現(xiàn)出相關(guān)性[8-9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，健康女性的陰道菌群絕大多數(shù)為厚壁菌門，乳酸桿菌屬同樣占比較高，而加德納菌、奇異菌屬等豐度不高[10]。陰道微環(huán)境處于平衡狀態(tài)時為菌群提供寄居，常見為革蘭陽性需氧菌、兼性厭氧菌及革蘭陰性需氧菌等，該類菌群主要聚集于陰道側(cè)壁黏膜皺褶與穹隆中，極少部分在宮頸位置聚集。既往研究在女性陰道分泌物中分離出50 多種不同的菌群，而健康女性陰道中以乳酸桿菌為主[11]。女性陰道微環(huán)境菌群構(gòu)成處于平衡狀態(tài)時，具有預(yù)防病原體侵襲的功能，而確保陰道菌群環(huán)境平衡的pH值是由乳酸桿菌、雌激素來調(diào)節(jié)[12]。乳酸桿菌可調(diào)控陰道微環(huán)境的平衡，同時還可以分泌大量乳酸桿菌預(yù)防致病菌群侵襲，提高陰道局部抵御感染、腫瘤等疾病。研究還發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可活化為細(xì)胞外糖類包裹病原菌侵襲宮頸上皮細(xì)胞形成生物膜，避免病原菌進一步發(fā)展[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIN I組乳酸桿菌菌屬（53.50%）低于對照組（62.76%）和CIN Ⅱ/Ⅲ組（72.01%），從而反映陰道微生物菌群環(huán)境均衡性發(fā)生變化，可能會造成CIN 進展，而CIN Ⅱ/Ⅲ組乳酸桿菌高于對照組（72.01% VS 62.76%）。本研究中，CIN I組乳酸桿菌屬含量下降，通常陰道菌群中的乳酸桿菌具有維持陰道微環(huán)境平衡、抑制病原菌生長，提高陰道局部抵御感染的作用。乳酸桿菌可形成空間性占位從而保護宮頸上皮細(xì)胞，避免病原菌黏附，減少病原菌黏附與感染。CIN I組乳酸桿菌屬含量降低提示陰道菌群平衡紊亂導(dǎo)致陰道微環(huán)境發(fā)生變化，宮頸上皮感染高危型人乳頭瘤病毒的易感性風(fēng)險較高[14]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果趨于一致，CIN I組加德納菌屬（19.16%）高于對照組（14.11%）和CIN Ⅱ/Ⅲ組（12.16%）；同時CIN I組奇異菌屬豐度同樣高于對照組和CIN Ⅱ/Ⅲ組。加德納菌屬可作用于CD59 調(diào)節(jié)分子活化炎癥信號通路，大量釋放細(xì)胞溶解素，造成陰道上皮細(xì)胞凋亡從而減少乳酸桿菌定植，陰道微環(huán)境失衡的風(fēng)險升高。本研究說明宮頸病變與奇異菌豐度關(guān)系密切。COOREVITS 等[15]研究基于3D 培養(yǎng)條件，分析陰道上皮細(xì)胞模型同樣證實了奇異菌可增強炎癥反應(yīng)，改變陰道微環(huán)境；同時還發(fā)現(xiàn)奇異菌的豐度升高可能預(yù)示著其影響宮頸上皮內(nèi)細(xì)胞。

綜上所述，從女性陰道菌群的構(gòu)成發(fā)現(xiàn)不同宮頸上皮內(nèi)瘤變患者陰道菌群豐度變化與宮頸病變具有一定的關(guān)聯(lián)。