細顆粒物對Apo E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊及其內部巨噬細胞表型的影響

李永輝，崔佳，趙培，路永剛

1 河北省疾病預防控制中心,石家莊050051；2 河北省人民醫院

近年來研究發現，空氣中可吸入細顆粒物(PM2.5)是加速動脈粥樣硬化(AS)發生發展及導致冠心病發病的重要原因，引起了廣泛的社會關注[1]。隨著研究不斷深入，逐漸發現AS的病理變化存在變質、滲出和增生等炎癥的基本特征，病變過程中始終都有各種炎癥細胞和大量炎癥介質的參與[2]。研究認為，PM2.5能夠避開呼吸系統屏障進入血液循環，并對人體的免疫系統造成一定影響[3，4]。循環白細胞(主要是單核細胞和巨噬細胞)是先天免疫系統的組成部分，循環中的單核細胞遷移到病變血管內膜處分化為巨噬細胞，巨噬細胞分泌功能的異質性改變決定了AS的進展。巨噬細胞可分為兩個亞群：第一個亞群由典型激活的巨噬細胞(M1)組成，可釋放大量炎癥細胞因子[如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素12(IL-12)等]，引起白細胞募集、活化、分化，具有促進AS斑塊發展的作用；第二個亞群由交替激活的巨噬細胞(M2)組成，具有抗炎[如精氨酸酶1(Arg-1)、CD206]和抗AS作用[5，6]。因此，M1型與M2型巨噬細胞的平衡對AS的發展或抑制至關重要。2018年1月～2019年12月，我們觀察了PM2.5能否誘導巨噬細胞M1/M2表型轉化從而促進AS的發生發展。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Apo E-/-小鼠，8周齡，體質量(20±2)g，購自卡文斯實驗動物有限公司(中國常州),飼養于河北省人民醫院臨床研究中心SPF級動物房(溫度20～24 ℃，濕度45%～55%)，每籠5～6只。高脂飼料(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇,江蘇美迪森生物醫藥有限公司)；Movat染液(Servicebio公司)，天狼星紅染液(Sigma公司)；MAC-2、β-actin檢測試劑盒(Santa Cruz 公司)，山羊抗兔IgG(Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；基因引物由英濰捷基貿易有限公司合成，熒光定量PCR檢測試劑盒(RR820A，大連寶生物公司)；多用途低溫離心機(Eppendorf 公司)，倒置光學顯微鏡(DMI3000B)，組織包埋機(EG11508)、石蠟切片機(RM2135)均購自Leica公司，全自動凝膠成像系統(8845-S，美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PM2.5混懸液制備 采用TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器，24 h連續中流量采樣進行PM2.5收集。將收集的PM2.5用液氮冷凍干燥成粉末，于黑暗中4 ℃下儲存。每天應用前將10 mg的PM2.5粉末懸浮在4.8 mL生理鹽水中混勻，即為PM2.5混懸液。經檢測混懸液中重金屬的成分主要為鋁(Al)、釩(V)、鐵(Fe)、錳(Mn)、硒(Se)、銀(Ag)，其含量分別為0.273 02、0.002 16、0.446 58、0.016 04、0.000 68 μg/L。

1.2.2 動物分組與造模處理 將Apo E-/-小鼠隨機分為兩組各16只，均給予高脂飼料飼養8周；同時，PM2.5組和對照組分別氣管滴注PM2.5生理鹽水混懸液、生理鹽水0.3 mL，1次/d；PM2.5用量參考2017年石家莊地區正常成人每天PM2.5吸入量(65 μg/m3)，數據來自國際環保組織綠色和平2018年1月10日發布的《2017年中國365個城市PM2.5濃度排名》。

1.2.3 小鼠全血重金屬含量測定 8周后小鼠眼球取血，采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS,Thermo Fisher Scientific, USA)測定全血的重金屬含量(Al、V、Fe、Mn、Se、Ag)。

1.2.4 主動脈標本取材與處理 眼球取血后，在無菌條件下以3%水合氯醛腹腔麻醉并固定；打開小鼠胸腔，在生理壓力下應用冰生理鹽水灌流直至肝臟發白；充分暴露主動脈，剝離主動脈周圍結締組織；切取主動脈根部，用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，連續切片，用于Movat染色、天狼星紅染色及免疫組化染色；同時快速分離降主動脈，保存于液氮中，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2.5 主動脈根部斑塊面積及成分分析 將主動脈根部切成5 μm厚的石蠟切片，分成三部分。第一部分進行Movat染色，以染色面積評估斑塊大小；第二部分行天狼星紅染色后，評價斑塊內膠原含量變化，以染色面積占斑塊面積百分比表示；最后一部分行免疫組化染色，以抗人MAC-2抗體免疫組化染色評估斑塊內的巨噬細胞數量，以人β-actin抗體免疫組化染色評估斑塊內平滑肌細胞數量。用偏振光顯微鏡采集天狼星紅染色圖像，正置顯微鏡采集Movat染色和免疫組化染色圖像，均以Image Pro Plus6圖像分析軟件測算斑塊面積、分析陽性區域平均光密度值。

1.2.6 降主動脈斑塊內巨噬細胞表型標志性因子基因檢測 使用TRIzol兩步法抽提降主動脈的總RNA，按照逆轉錄試劑說明書進行實時熒光定量PCR。擴增條件：94 ℃ 40 s，70 ℃ 5 s，60 ℃ 15s ，72 ℃ 10 s，40個循環；以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt相對定量法表示基因相對表達量。斑塊內巨噬細胞表型標志性因子及內參基因熒光定量PCR反應引物序列，見表1。

2 結果

2.1 兩組全血中重金屬含量比較 PM2.5組全血中重金屬含量均較對照組升高，其中Al、V、Fe含量差異有統計學意義。見表2。

表1 降主動脈斑塊內巨噬細胞表型標志性因子及內參基因引物序列

2.2 兩組主動脈根部斑塊面積及成分比較 與對照組比較，PM2.5組主動脈根部斑塊面積增大，斑塊中巨噬細胞數量增加、膠原含量降低(P均<0.05)，而平滑肌數量無明顯變化。見表3。

表2 兩組全血中重金屬含量比較

表3 兩組主動脈根部斑塊面積及成分比較

2.3 兩組降主動脈斑塊內M1和M2型巨噬細胞標志性因子基因表達比較 與對照組比較，PM2.5組M1型巨噬細胞標志性因子iNOS、IL-12 mRNA表達增加，而M2型巨噬細胞標志性因子CD206、Arg-1 mRNA表達下降(P均<0.05)。見表4。

表4 兩組降主動脈斑塊內M1和M2型巨噬細胞標志性因子基因表達比較

3 討論

目前，以AS為病理基礎的心腦血管疾病成為人類死亡的首因。近年來，AS發病機制的炎癥學說成為研究熱點，AS被認為是一種在動脈管壁發生以脂質堆積和纖維斑塊形成為特征的慢性、低水平炎癥性疾病。循環白細胞(主要是單核細胞和巨噬細胞)是先天炎癥免疫的主要組成部分，是抵御異物的第一道防線[7，8]。近年來，大氣污染對AS患者的不利影響逐漸引起了人們的重視。研究發現，短期暴露于高濃度或長期暴露于低濃度PM2.5是AS進展的一個危險因素[9]，但其作用機制尚未完全闡明。

研究表明，巨噬細胞亞群M1/M2比例失衡能夠影響AS的發展方向以及斑塊的穩定性。M1型巨噬細胞釋放的炎癥因子，能加速AS斑塊的形成進展及斑塊不穩定性。M2型巨噬細胞既能發揮抗炎作用，又能進一步抑制AS發展。在AS斑塊損傷的早期，M2型巨噬細胞大量浸潤，斑塊趨于穩定；然而，在斑塊破裂時期，M1型巨噬細胞大量浸潤，促使炎癥因子分泌增加，使斑塊穩定性降低。iNOS能夠在活化的M1型巨噬細胞中高表達，并與鈣調蛋白結合產生大量的活性氧，其與周圍的NO自發反應形成ONOO。ONOO作為一種強氧化因子能夠造成氧化低密度脂蛋白的形成與聚集、內皮細胞損傷以及泡沫細胞形成。而且，過度產生的iNOS和ONOO都能激活經典的NF-κB通道，誘導產生更多的細胞因子和其他急性期反應物，進一步放大炎癥反應并損傷內皮功能[10],從而加速AS的發生與進展。IL-12具有調節Th1和Th2細胞之間平衡的作用，能誘導合成IFN-γ和TNF-α等炎癥因子，增強細胞免疫應答。研究表明，活化M1型巨噬細胞產生的IL-12可促進CD4+T細胞分泌干擾素γ，以加重機體炎癥反應，促進動脈硬化斑塊破裂和血栓形成[11]。Arg-1能夠導致免疫失活，并且在脂多糖和病原體所致炎癥反應中發揮重要作用。多項研宄表明，該酶能夠促進人主動脈平滑肌細胞的增殖[12]。因此，Arg-1可能是一個新的抗AS候選基因[13]。CD206又稱甘露糖受體C1型，是一種模式識別受體，是活化M2型巨噬細胞的表面標志[14]。其具有內吞和噬菌作用，與抗原提呈、信號轉導、先天性宿主免疫和后天適應性免疫反應有關[15]。

本研究發現，PM2.5作用后Apo E-/-小鼠主動脈斑塊面積增大，斑塊內巨噬細胞數量增多而膠原含量減少；這提示PM2.5暴露增強了血管內皮的免疫炎癥反應，這種免疫炎癥反應在PM2.5持續刺激下可能持續發生[16]，從而加速了AS的進程。進一步研究發現，在用PM2.5處理的Apo E-/-小鼠動脈斑塊中M1型巨噬細胞標志因子表達升高，M2型巨噬細胞標志因子表達降低。這表明PM2.5能促進巨噬細胞轉型為M1型，從而促進動脈粥樣斑塊發展；并能抑制巨噬細胞轉型為M2型，降低斑塊中平滑肌細胞和膠原等的合成，從而降低了斑塊的穩定性。因此，我們認為PM2.5暴露能夠促進Apo E-/-小鼠模型AS的進展，其可能的機制是血管內皮炎癥增強和巨噬細胞向M1型傾斜。