郭騰，商琰紅，李小芳，賈友超，王曉芳

河北大學附屬醫(yī)院 河北省腫瘤放化療機制與規(guī)程研究重點實驗室 河北大學臨床醫(yī)學院，河北保定071000

免疫治療在一定程度上改善了非小細胞肺癌(NSCLC)患者的結(jié)局，但現(xiàn)階段靶向治療仍是驅(qū)動基因陽性患者的主要治療手段，而精準的基因分型是精準靶向的基礎。美國臨床腫瘤學會(ASCO)指南推薦，表皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、ROS1受體酪氨酸激酶(ROS1)、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B(BRAF)驅(qū)動基因的分子狀態(tài)應作為常規(guī)獨立檢測，如上述結(jié)果均正常或樣本充足，還應對RET、人表皮生長因子受體2(HER2)、鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(MET)等驅(qū)動基因進行檢測，尋找有效靶點。由于腫瘤的異質(zhì)性，不同個體間藥物療效存在差異；而療效預測標志物有助于對患者進行分層、預估療效，及時予以干預。靶向藥物效果雖好，但隨著時間推移及治療方案的變化，腫瘤細胞持續(xù)進化，最終不可避免地會出現(xiàn)耐藥。因此，對耐藥患者進行二次甚至多次檢測，評估和跟蹤腫瘤生物學變化，有助于改善預后。腫瘤組織是臨床上最常選取的檢測材料，但實踐中受多種原因限制，導致肺癌組織標本檢測率并不高，也不適合對基因型連續(xù)監(jiān)測，因而基于驅(qū)動基因變異靶點的個體化治療策略難以實施。由此，精準醫(yī)學的重點正日益轉(zhuǎn)向液體活檢，其中循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)作為生物標志物的能力被廣泛研究。ctDNA在NSCLC患者EGFR檢測中的臨床效用和實用性已被證實，并被批準用于指導EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)靶向治療的選擇。因此，本文就ctDNA在驅(qū)動基因陽性NSCLC療效預測及耐藥機制探索的研究綜述如下。

1 EGFR

我國大陸地區(qū)晚期NSCLC患者中，EGFR總突變率為50.2%，EGFR激活突變率為48.0%，是我國NSCLC患者最常見、最重要的驅(qū)動基因突變類型。

1.1 療效預測 對于EGFR突變陽性患者，EGFR-TKIs有效率﹥70%，但不同個體間療效和預后存在差異。療效預測標志物有助于臨床判斷藥物療效，并預測病情走向。

近期Iwama等[1]針對組織檢測EGFR突變陽性的Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者進行了一項多中心、前瞻性的研究，該研究通過分析患者基線及EGFR-TKIs治療期間直至疾病進展的血漿ctDNA發(fā)現(xiàn)，EGFR激活突變在12周或24周清除的患者中位無進展生存期(PFS)較同時點突變?nèi)钥蓹z測到者大大延長，36周檢測EGFR激活突變增加的患者中位PFS更短。這證實了ctDNA EGFR突變狀態(tài)的動態(tài)變化對TKIs療效有預測作用。在不同研究中，具有療效預測作用的ctDNA檢測時點存在差異，這可能與ctDNA檢測技術(shù)或標準不一致有關(guān)。Marchetti等[2]研究發(fā)現(xiàn)，TKIs治療14 d后EGFR半定量指數(shù)下降率≥50%的患者，在治療2個月時腫瘤縮小百分比大于EGFR突變水平下降率<50%者，表明對ctDNA中EGFR突變進行定量也有助于預測療效。

伴隨著三代EGFR-TKIs相關(guān)研究的逐漸深入，T790M突變用于預測TKIs療效與疾病進展的觀點逐漸出現(xiàn)[3]；但其作為一種亞克隆突變的突變水平遠低于EGFR，不能代表EGFR整體狀態(tài)，故單獨監(jiān)測T790M清除作為治療預測因子可靠性差。考慮到EGFR突變狀態(tài)作為預測因子的穩(wěn)定性，T790M/EGFR激活突變可能更適合用于奧西替尼療效預測[4]。Oxnard等[5]對奧西替尼治療耐藥后患者血漿ctDNA進行分析，發(fā)現(xiàn)耐藥時T790M突變清除患者中位治療停止時間(TTD)更短；進一步研究表明，T790M突變清除患者預先存在耐藥克隆，并出現(xiàn)了早期耐藥，而晚期耐藥的患者則更有可能維持T790M并獲得C797S突變，表明T790M及EGFR突變水平改變情況可用于預估耐藥模式、預測療效。

Buttitta等[6]在奧西替尼治療病情進展患者血漿中發(fā)現(xiàn)多種耐藥改變，而在奧西替尼治療1個月、EGFR激活突變未清除患者血漿中也檢出了這些耐藥改變，包括MET和HER2基因擴增、KRAS和PIK3CA基因突變，表明這些耐藥誘導突變已存在腫瘤細胞中，再次證實了ctDNA在發(fā)現(xiàn)早期耐藥及療效預測方面的潛力。該研究團隊提出，如治療第15、30天，EGFR激活突變未完全清除或顯著降低，則建議行大規(guī)模平行測序進行血漿評估，根據(jù)情況修改治療方案。而早期發(fā)現(xiàn)耐藥機制中相關(guān)的突變，對于患者選擇特定治療方案可能很重要，因藥物聯(lián)合治療雙突變或多個突變患者有效。

此外，在EGFR-TKIs治療期間，ctDNA EGFR激活突變陽性的等位基因數(shù)量增加發(fā)生在疾病進展前或進展時[1]，EGFR耐藥突變的動態(tài)變化可能早于放射學結(jié)果，顯示了影像學進展前動態(tài)監(jiān)測ctDNA EGFR突變對EGFR-TKIs治療反應的預測價值。這對調(diào)整治療方案的時機提出了挑戰(zhàn)。目前，APPLE-EORTC試驗[3]正在對治療時機的選擇進行探索。

1.2 耐藥機制 EGFR-TKIs耐藥機制是多因素的，治療期間發(fā)現(xiàn)的亞克隆或分支突變可能在患者分層和指導靶向治療方面具有實用價值。其中一些抗性是可靶向的，但還有一些抗性機制可能目前尚無有效治療方案，而該機制的發(fā)現(xiàn)有助于進一步探索新藥。目前已知的耐藥機制大多是基于組織活檢發(fā)現(xiàn)的，但實際上除了組織轉(zhuǎn)化外，已證實的TKIs耐藥機制大多在血漿ctDNA中得到了驗證[7]。其中EGFR T790M突變最常見于第一、二代EGFR-TKIs治療后的患者，血漿ctDNA檢測T790M突變篩選奧西替尼用藥人群已應用于臨床。其他耐藥機制包括MET、HER2擴增及PIK3CA、PTEN基因異常，基于ctDNA的基因組分析已被用來描述耐藥機制。許多通過ctDNA尋找耐藥機制并對耐藥變化動態(tài)監(jiān)測，以達到輔助臨床治療、延長生存的成功案例已有報道[8]。

FLAURA研究中奧西替尼的良好表現(xiàn)使其進入一線治療的行列。AURA研究利用第二代測序(NGS)技術(shù)在奧西替尼耐藥患者血漿ctDNA檢測到C797S突變，但未檢測到T790M突變，提示奧西替尼作為一線治療時，可能不產(chǎn)生T790M突變作為其耐藥機制[9]。這可能有潛在的重大臨床意義，因為喹唑啉類EGFR抑制劑包括吉非替尼等已被證明在T790M缺失時能夠有效抑制C797S突變，但在復雜的耐藥背景下這種可能性有待進一步研究。其他發(fā)現(xiàn)的已確認的基因組耐藥機制包括EGFR下游通路(MAPK信號通路)或旁路(MET、HER2)激活，提示一線奧西替尼治療疾病進展后，聯(lián)合治療可能有助于改善患者預后。50%的耐藥后血漿樣本中未檢測到ctDNA，提示部分患者分子改變只能在組織水平檢測到或存在其他非基因組相關(guān)耐藥機制。

如前所述，部分耐藥機制在TKIs治療前即與敏感突變同時存在，可能表現(xiàn)為較小克隆而不易發(fā)現(xiàn)；在TKIs治療后敏感突變減少，原有小克隆成為主要耐藥機制。例如1例T790M突變陽性患者在奧西替尼治療前，在6%的細胞中存在MET擴增；奧西替尼治療后，在94%細胞中檢測到MET擴增，它成為主要耐藥機制[5]。在監(jiān)測三代EGFR-TKIs羅西替尼ctDNA時發(fā)現(xiàn)，原有MET、HER2、EGFR基因拷貝水平增高多發(fā)生在原發(fā)耐藥患者中[10]，這可能與早期耐藥相關(guān)。如果能在早期耐藥階段給予有效處理，將有助于改善患者預后。

此外，ctDNA在發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制方面也有優(yōu)秀表現(xiàn)。對奧西替尼耐藥患者血漿ctDNA進行NGS檢測，耐藥血漿中檢測到EGFR Leu792突變(包括L792F/Y/H)[11]，部分病例中甚至出現(xiàn)了L792F/Y/H 突變等位基因總和(12%)遠高于C797S(1%)，成為新獲得的主要突變的現(xiàn)象，而此種突變可能與三代EGFR-TKIs耐藥相關(guān)[12]。EGFR L858R/T790M雙突變患者經(jīng)三線奧西替尼治療進展后，ctDNA檢測到了M766Q突變[13]，該突變也可介導第一、二代EGFR-TKIs的耐藥。另外，羅西替尼耐藥血漿中發(fā)現(xiàn)了新的EGFR L798I突變可能與耐藥相關(guān)[10]。

部分患者EGFR-TKIs治療后發(fā)生小細胞肺癌(SCLC)轉(zhuǎn)化，難以通過ctDNA檢測該耐藥機制，給ctDNA用于臨床實踐帶來了挑戰(zhàn)。Minari等[14]通過對試驗中患者血漿進行EGFR分子檢測，認為在T790M/EGFR激活突變比例較低的情況下，應考慮組織活檢以排除SCLC轉(zhuǎn)化和其他伴隨耐藥機制的存在。

2 ALK

ALK重排是2%～7% NSCLC患者的致癌驅(qū)動因素。當組織留取困難或不足以進行檢測時，通過ctDNA檢測ALK指導臨床用藥的成功案例已被報道。但是，由于PCR很難檢測到ctDNA中ALK和ROS1等基因重排事件，ctDNA相關(guān)研究進展緩慢。

2.1 療效預測 多個研究指出，ctDAN ALK變異等位基因改變頻率(VAF)變化與ALK抑制劑治療反應密切相關(guān)。2019年ASCO會議上一項研究表明，動態(tài)監(jiān)測ctDNA可以預測勞拉替尼對二代TKIs失敗后ALK陽性NSCLC患者的療效。該研究對57例患者配對血漿樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)用藥6周后ctDNA降低與更好的應答反應和更長的PFS有關(guān)。

此外，不同靶向藥對不同突變敏感性不同；監(jiān)測ctDNA動態(tài)耐藥過程，明確耐藥改變，有助于預測藥物療效。例如，勞拉替尼對G1202R/del、L1196M、F1174X、G1269A和I1171X等ALK常見耐藥突變均具有抗癌活性，但客觀緩解率(ORR)從42%～89%。其中，勞拉替尼在G1202R/del和I1171X突變患者中，ORR分別為57%和75%，中位響應持續(xù)時間(DOR)分別為7.0個月和4.2個月，中位PFS分別為8.2個月和5.5個月[15]。即使是面對阿來替尼34.8個月的超長PFS[16]，ctDNA在預測藥物療效、發(fā)現(xiàn)早期耐藥、評估預后等方面都有著重要作用。

2.2 耐藥機制 克唑替尼作為一代ALK-TKIs，中位PFS為10.9個月，但不久發(fā)現(xiàn)約30%出現(xiàn)原發(fā)耐藥，部分患者在1～2年內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)耐藥。為解決克唑替尼耐藥問題，一系列ALK抑制劑問世，一定程度上改善著患者的預后，但最終也不可避免地出現(xiàn)耐藥。盡管有著共同的分子驅(qū)動因素，但在不同靶向藥物的壓力選擇下，患者突變譜不斷變化。Shaw等[17]發(fā)現(xiàn)，勞拉替尼失敗患者可能存在新的突變使其對克唑替尼重新敏感，該發(fā)現(xiàn)強調(diào)了獲得性耐藥機制的確定對ALK重排患者爭取治療決策的重要作用。大量基于組織的耐藥機制已被證實，但液體活檢相關(guān)的研究不多。

一項基于血漿ctDNA檢測的回顧性分析顯示，ALK陽性患者耐藥機制主要包括ALK酪氨酸激酶域突變、ALK融合基因擴增、其他信號通路激活[18]。其中，ALK耐藥突變種類多樣，不同靶向藥突變譜可能存在差異，常見耐藥突變有G1202R、F1174C/V/L和I1171T/N。二代ALK-TKIs治療進展后出現(xiàn)的ALK突變多表現(xiàn)為復合突變，與組織檢測結(jié)果一致[19]。但組織檢測結(jié)果中，包含復合突變患者所占比例更低，這可能與腫瘤異質(zhì)性有關(guān)，說明ctDNA受異質(zhì)性影響更小。其他脫靶致癌改變包括KRAS、BRAF、EGFR、MET突變及CCND2、FGFR2、MYC擴增等，但它們在ALK-TKIs耐藥中的地位有待進一步研究。Guo等[20]對1例先后接受了一、二、三代ALK-TKIs治療的ALK陽性肺癌患者進行ctDAN連續(xù)收集，發(fā)現(xiàn)了MET擴增可能是一種新的勞拉替尼耐藥機制，獲得性ALK T1151Sins突變可能是一種新的色瑞替尼抗性機制。Hassan等[21]報告了1例克唑替尼、阿來替尼治療后疾病進展的病例，患者ctDNA提示ALK G1202R突變，給予勞拉替尼治療，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移灶減小，同時G1202R突變清除，但出現(xiàn)大量心包積液，心包積液石蠟包埋標本檢出SCLC轉(zhuǎn)化并伴有ALK融合。另外，還有報道指出ALK陽性患者在阿來替尼治療后出現(xiàn)鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)化。再次提醒我們，如果臨床可行，組織學檢查和基于組織的再次活檢仍然是評估耐藥機制和指導隨后的合理臨床治療的金標準。

3 KRAS

KRAS突變是NSCLC中常見的突變，其在亞洲肺腺癌中突變發(fā)生率11.2%，低于西方國家，是在疾病早期即獲得的主干突變，也是常見的耐藥突變。AMG 510被FDA授予KRAS G12C突變陽性NSCLC孤兒藥的資格，MRTX849等多種KRAS靶向藥正在進行臨床試驗，免疫治療在KRAS陽性NSCLC中也有研究前景。有研究顯示，ctDNA KRAS突變狀態(tài)可作為Onvansertib聯(lián)合FOLFIRI和Avastin治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌腫瘤突變負荷及治療反應的早期標志，但ctDNA在KRAS陽性NSCLC的作用有待進一步研究。

一項前瞻性研究收集了32例KRAS突變轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者的ctDNA及循環(huán)腫瘤細胞(CTC)，并采用微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)法進行了KRAS突變的檢測，發(fā)現(xiàn)ctDNA檢測靈敏度更高(78%vs34%)[22]，尤其是在多部位轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移患者中[23]，支持ctDNA作為NSCLC分子分析的敏感標本類型。與EGFR、ALK陽性患者一樣，ctDNA拷貝數(shù)變化與治療效果具有相關(guān)性，這可能與腫瘤負荷改變有關(guān)。此外，有數(shù)據(jù)顯示KRAS突變的腫瘤與高突變負荷相關(guān)，更有可能表達PD-L1[24]，提示血漿ctDNA監(jiān)測KRAS有可能在PD1、PD-L1為靶點的免疫治療中鑒別影像學進展真假提供幫助。

4 ROS1

ROS1常見的致病性改變?yōu)榛蛑嘏牛伟┗颊咧兄挥?.8%～1.7%的患者會發(fā)生，目前尚無特異性的ROS1靶向藥。由于ROS1與ALK結(jié)構(gòu)的相似性，除阿來替尼外，其他ALK抑制劑多能發(fā)揮抗ROS1作用，克唑替尼為一線藥物。目前，ctDNA在ROS1靶向藥的預測作用未見相關(guān)報道。

Dagogo-Jack等[25]通過分析血漿ctDNA發(fā)現(xiàn)，ROS1陽性患者克唑替尼耐藥后檢出ROS1耐藥突變，支持ROS1激酶域突變是克唑替尼耐藥的重要原因這一觀點。ctDNA還可以檢測到脫靶導致的耐藥，如KIT或KRAS激活。此外，在克唑替尼治療復發(fā)患者的血漿中檢測到了BRAF V600E、PIK3CA E545K，但尚不能確認是否與耐藥有關(guān)。

5 BRAF

BRAF在NSCLC中突變率為1%～3%，多發(fā)生在腺癌中，V600E是BRAF基因常見突變位點。目前，針對BRAF致病性突變的藥物包括MEK抑制劑和RAF抑制劑。曲美替尼聯(lián)合達菲替尼是BRAF V600E/K突變陽性患者的標準治療，免疫治療也有不錯效果。ctDNA在BRAF突變陽性患者的研究主要集中在黑色素瘤方向，NSCLC中相關(guān)研究較少。

Guibert等[26]對6例BRAF V600E突變陽性的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者進行ctDNA監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA檢測到的BRAF突變拷貝數(shù)與患者對BRAF-TKIs的反應有明顯相關(guān)性，其動態(tài)變化與腫瘤負荷也有相關(guān)性。進一步對BRAF-TKIs耐藥后患者ctDNA進行分析，結(jié)果顯示突變型與野生型拷貝數(shù)的比例與腫瘤負荷存在相關(guān)性，表現(xiàn)為腫瘤負荷增大、BRAF突變拷貝減少、野生型增多，提示BRAF突變克隆不再占主導地位。同時，除已知BRAF突變外，還檢測到了A132C-IDH1突變，此突變可能參與了BRAF-TKIs耐藥機制。

6 MET

MET激活途徑包括突變、擴增及蛋白過表達，以MET拷貝數(shù)增加和14外顯子跳躍突變?yōu)橹鳎Ｊ芤嬗贛ET-TKIs，如克唑替尼、卡博替尼等。其中，MET 14外顯子跳躍突變不與EGFR、ALK等驅(qū)動突變共存，更可能作為獨立致癌驅(qū)動基因，存在于1%～3%的NSCLC患者中。1例病案報告顯示，ctDNA VAF變化與腫瘤大小變化一致，患者達部分緩解時，MET突變檢測陰性[27]。因此，ctDNA可能存在療效預測的潛力，但仍需進一步研究。Rotow等[28]對晚期MET 14外顯子突變患者ctDNA進行測序分析，檢測到頻繁的RAS-MAPK通路基因改變，如KRAS、NF1。臨床前模型證實這些改變促進了MET-TKIs的耐藥性產(chǎn)生，以MAPK信號通路為靶點的聯(lián)合治療可能改善MET-TKIs耐藥患者療效。

7 RET和HER2

RET重排發(fā)生在1%～2%的NSCLC患者中，多種具有抗RET活性的多激酶酪氨酸抑制劑，包括卡博替尼、凡德他尼等都表現(xiàn)了一定的抗腫瘤活性，RET激酶抑制劑，如LOXO-292、BLU-667等也顯示了良好前景。2%～4%的NSCLC存在HER2突變，其中90%存在20外顯子的插入，目前尚無靶向藥獲批。吡咯替尼在HER2突變NSCLC中顯示出良好安全性和抗腫瘤活性。但無論是RET基因重排還是HER2突變，ctDNA相關(guān)研究有待深入開展。

目前，臨床多通過影像學手段對腫瘤進行評估，但影像學進展多在分子生物學或細胞學改變之后，使其具有一定的滯后性；而臨床常用的血清腫瘤標志物特異性有待提高。ctDNA作為一種極易獲得的生物標志物，縱向評估腫瘤患者的進化和動態(tài)耐藥情況，有助于預測藥物療效、耐藥監(jiān)測及探索耐藥機制，展現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性、耐藥機制多樣性和復雜性。如能對發(fā)現(xiàn)早期耐藥患者更早地采取措施，如聯(lián)合靶向用藥，有可能阻止或延緩耐藥的進程，獲得更持久的靶向療效。越來越多的臨床試驗將ctDNA加入研究范圍，隨著對ctDNA認識的不斷加深，ctDNA應用范圍將越來越廣，有希望參與腫瘤管理全程。但需要指出的是，血液ctDNA中良性體細胞異質(zhì)性是一個重要混雜因素。在沒有腫瘤的患者血漿游離DNA中，有可能識別到相似的TP53改變。因此，在ctDNA中檢測癌癥驅(qū)動基因的突變不能等同于腫瘤的證據(jù)。如臨床情況允許，基于組織的基因檢測仍是必要的。ctDNA可作為組織活檢的補充，提高基因分型準確率，使靶向治療更加精準。此外，對ctDNA的檢測和分析制定統(tǒng)一標準，對檢測技術(shù)進行優(yōu)化，提高靈敏度，仍是ctDNA相關(guān)工作中亟待解決的問題。