不同植物生長調節劑濃度組合消毒方式及培養基蔗糖濃度對梭砂貝母愈傷組織誘導的影響

歐珠朗杰 賀凱 米瑪潘多

摘 要：以梭砂貝母鱗莖為外植體，研究梭砂貝母組織培養中植物不同生長調節劑種類和濃度組合、外植體不同消毒方式及培養基蔗糖濃度對愈傷組織的誘導結果比較。結果表明，適宜誘導梭砂貝母鱗莖的植物生長調節劑組合及濃度為6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養基，用75%的乙醇消毒外植體30s，再用0.1%的升汞消毒10min污染率較低，蔗糖濃度為3%時，愈傷組織誘導率較高，結構結實、顏色淡黃且褐化率低。

關鍵詞：梭砂貝母;外植體;愈傷組織;植物生長調節劑

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930007

引言

梭砂貝母（Fritillaria delavayi Franch.）屬百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria），藏語為阿皮卡，是白合科多年生草本植物，地下鱗莖外表類白色或淺黃棕色，部分具零星棕色斑點[1]。在西藏海拔4100m以上的高山流石灘均有出產，云南西北部、四川西部、青海南部（雜多、囊謙）也有出產。為重要的藏藥材，用于陰虛勞嗽、肺熱燥咳，干咳少痰，具有潤肺清熱，化痰功效[1]。由于梭砂貝母藥用價值高，而其生長環境特殊、分布分散，自然繁殖系數低，商品藥材完全依靠采挖野生資源并連年過度采挖，導致資源日趨減少，面臨枯竭危險，破壞了梭砂貝母生長環境、種群自然更新，使梭砂貝母資源陷入匱乏。應用植物組織培養技術人工擴繁梭砂貝母資源，可不受季節、地域的影響，后代遺傳性能穩定，具有很大的發展前景和極其重要的實際意義。目前，國內外對梭砂貝母的研究主要集中在化學成分、藥效方面，對其栽培技術方面的研究相對較少，尚無針對梭砂貝母的較成熟組培技術參數[2]。本文通過人工條件下組織培養梭砂貝母，從梭砂貝母不同生長調節劑濃度及組合配比、不同消毒方式、培養基蔗糖濃度等方面探究梭砂貝母培養技術并進行分析，得出相關技術參數，提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為2020年7月采集于西藏山南市扎囊縣境內，生長于海拔4650m的高山流石灘的梭砂貝母的鱗莖。從其鱗莖中選取無病害乳白色鱗莖進行實驗室無菌處理，將切成適宜大小的鱗莖小塊，接種于不同濃度植物生長調節劑組合濃度的MS培養基上，進行調控培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基及母液的配制

以MS培養基（大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質）為基本培養基分別加入2%、3%、4%的蔗糖和7g·L-1的瓊脂，pH值調至5.8，攪拌均勻，添加不同濃度的2， 4-D，6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）激素，分裝于培養瓶。

2， 4-D、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6-BA）等植物生長調節物質，分別配成母液（0.1mg·mL-1）。配制方法：分別稱取2， 4-D、6-BA和NAA各10mg，將NAA用少量（1mL）無水乙醇預溶，將6-BA用少量（1mL）物質的量濃度為0.1mol·L-1的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最后分別定容至100mL，即得質量濃度為0.1mg·mL-1的母液[3]。

1.2.2 外植體的處理

組培用梭砂貝母鱗莖取自自然生境，外植體內外附有大量的微生物，外植體能否有效消毒是組織培養成功與否的重要影響因素[4]。消毒要求把材料表面和組織內的各種微生物殺滅干凈，只輕微損傷甚至不損傷組織材料而達到不影響外植體組織活力的目的[4]。

選取梭砂貝母地下鱗莖先用流水沖洗1h以上，根據試驗設計進行3種不同的消毒方式（表1），用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙將外植體表面的水吸干，將其切成0.5cm，厚度為0.2cm左右大小相近的小塊，接種到培養基上。

1.2.3 愈傷組織的誘導

根據外植體消毒處理結果，選擇消毒效果良好的消毒方法，將梭砂貝母適宜大小鱗莖小塊接種在附加不同濃度AA、2， 4-D、BA組合及不同濃度蔗糖培養基上，設蔗糖濃度為2%、3%、4%的培養基，比較蔗糖和植物生長調節劑濃度組合對梭砂貝母愈傷組織生長的影響[5]。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體污染的影響

從表1可以看出，僅用75%乙醇消毒30s的外植體污染率最高;75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒10in次之;用75乙醇消毒材料30s，再用0.1%的升汞消毒20min的外植體污染率最低。

3種消毒方法中，第1種方法污染率最高，第3種消毒方法污染率最低，但第3種消毒方法使鱗莖褐變率達90%以上。因此，第2種消毒方法較適合鱗莖的消毒。

2.2 植物生長調節劑對外植體愈傷組織誘導的影響

植物生長調節劑是植物組織培養過程中外植體脫分化形成愈傷組織的關鍵因素，形成愈傷組織的量和質量由培養基中不同植物生長調節劑的相對濃度控制，而不是這些物質的絕對濃度決定[5]。采用上述第2種消毒方法消毒的梭砂貝母鱗莖接種于附加2， 4-D，6-BA，NAA的6種培養基。結果（表2）表明，在6-BA 0.5mg·L-1加2， 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養基對鱗莖愈傷組織誘導率最高，均達到75%。

2.3 蔗糖濃度對外植體愈傷組織誘導的影響

選取相同適宜消毒方法和植物生調節劑濃度組合的培養基，其蔗糖濃度為3%時，外植體愈傷組織誘導率較高（表3）;蔗糖濃度為2%、2.5%、3.5%、4%時，外植體的愈傷組織誘導率均較低;其中4%時外植體愈傷組織誘導率最低，可見誘導愈傷組織培養基較適宜的蔗糖濃度為3%。

3 結論

在本研究中，以梭砂貝母鱗莖作為外植體，分別研究適宜誘導愈傷組織的外植體消毒劑濃度、培養基蔗糖濃度及植物生長調節劑種類和濃度組合。

通過試驗發現，在培養基中添加不同濃度的蔗糖對愈傷組織誘導有一定程度的影響，蔗糖濃度為3%時，外植體的愈傷組織誘導率較高;較低（2%）或較高（4%）均抑制外植體脫分化形成愈傷組織。較低或較高的蔗糖濃度使愈傷組織呈透明或淡黃色水澤狀，結構硬板，形成量小，易褐化死亡，不利于進一步轉接繁殖、分化和成苗[6]。誘導愈傷組織2種較好的培養基分別是MS加6-BA 0.5mg·L-1加2， 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1。可為今后克服梭砂貝母組培與擴繁試驗的盲目性，節約人力、物力、財力提供理論依據。

參考文獻

[1] 歐珠朗杰.藏藥材——梭砂貝母組織培養研究[J].西藏科技，2012（09）：72-73.

[2]馬吉義.暗紫貝母組織培養和快速繁殖的研究[D].西寧：青海師范大學，2011.

[3]歐珠朗杰，米瑪潘多.梭砂貝母鱗莖組織培養研究[J].南方農業，2019，13（27）：129-130.

[4]張志良，戳偉青.植物生理學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2002.

[5]唐進，汪發纘.中國植物志[M].第14卷.北京：科學出版社，1980：104-105.

[6]蔡朝暉，李萍，高山林.中藥貝母的組織培養研究狀況[J].中草藥，1998，29（04）：272-178.

（責任編輯 ?李媛媛）