成品與臨用前配制氯化鉀氯化鈉注射液致痛作用比較及機制分析

王放，曹方引，劉園，張弛，郭俊，陳重華

四川大學華西藥學院，成都610041

靜脈補鉀是臨床治療低鉀血癥的有效方法之一[1]，但靜脈補鉀易導致輸注部位疼痛，甚至發生靜脈炎，給患者帶來治療痛苦，極大影響患者的依從性。因此，尋找較少或較輕引起患者疼痛的補鉀方法具有重要臨床意義。0.3%氯化鉀氯化鈉注射液簡稱NK注射液，是我國參考美國及歐盟藥典標準研制的一種成品氯化鉀氯化鈉注射液。動物實驗顯示[2]，以臨床最大輸注速度和劑量給予家兔耳緣靜脈輸注NK注射液，家兔無疼痛行為反應，對輸注血管局部刺激性的組織學觀察與生理鹽水相同。鉀離子是一種致痛因子，注入體內能引起疼痛反應[3]。2018年4～8月，我們采用同步給予實驗小鼠腹腔及足底皮下注射NK注射液、臨用前配制氯化鉀氯化鈉注射液(簡稱PK注射液，與NK藥物氯化鉀含量相同)致痛，比較動物出現扭體、抖足、抬足、跛行等可測量疼痛反應行為的差異，間接驗證NK注射液致痛作用較少或較輕；同時檢測疼痛傳導神經通路上脊髓背角的P物質(SP)、NK-1受體(NK1R)、谷氨酸(Glu)及腦組織SP、Glu的表達，以從多方面分析不同氯化鉀氯化鈉注射液致痛差異的原因。

1 材料與方法

1.1 主要材料 動物：SPF級雄性昆明鼠，體質量(20±2)g，購于成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2015-030]，常規飼養于華西藥學院IVC實驗動物房[SYXK(川)2018-113]。藥物與試劑：NK注射液(商品名美佳萊)為四川奇力制藥產品，規格250 mL，含氯化鉀0.75 g、氯化鈉2.25 g，批號180317；PK注射液：10 mL注射器取9.7 mL 0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司)于EP管(10 mL)，1 mL注射器取10%氯化鉀注射液(湖北科倫藥業有限公司)0.3 mL加入EP管，即刻取藥液用于足底皮下或腹腔注射。兔抗SP、NK1R、Glu多克隆抗體，購于武漢博士德生物有限公司；GTVisionTMⅢ型免疫組化檢測試劑盒(含DAB)購于基因科技(上海)股份有限公司；SP、Glu ELISA試劑盒購于武漢基因美有限公司。主要儀器：BX53F型光學顯微鏡及圖像采集系統(日本Olympus公司)；iMark酶標儀(日本BIO-RAD公司)；臺式高速冷凍離心機(TGL-16M，上海盧湘儀公司)；電子天平(BSM 220.4，上海卓精公司)。

1.2 致痛作用觀察方法

1.2.1 腹腔注射法(扭體法) 取SPF級雄性昆明鼠30只，隨機均分為對照組、NK組及PK組各10只，分別給予腹腔注射生理鹽水注射液(NS注射液)、NK注射液、PK注射液0.1 mL/10 g；注射完畢即開始觀察小鼠反應，并在小鼠扭體反應出現頻率最高，反應最劇烈時麻醉取材，記錄15 min內出現扭體的動物數[3]。

1.2.2 足底皮下注射法 動物、分組同1.2.1，分別在小鼠右足足底皮下注射NS注射液、NK注射液、PK注射液30 μL/只；注射完畢即開始觀察3 min內小鼠的行為反應，并記錄得分情況，計算疼痛評分[3]。疼痛評分=Σ各行為得分×各行為持續時間(s)/180 s。

1.3 致痛機制分析方法

1.3.1 腦組織中SP、Glu檢測 采用ELISA法。1.2.1實驗觀察完畢后，即以4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠；切下頭顱，迅速冰上開顱，剝取腦組織；分離出下丘腦和剩余腦組織，稱重，液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存。取下丘腦組織，加入一定量的PBS(pH 7.4)，冰浴中充分勻漿；2 500 r/min離心20 min，收集上清。ELISA法測定下丘腦中的SP、Glu含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3.2 脊髓背角組織中SP、NK1R、Glu檢測 采用免疫組化法。1.2.2實驗觀察完畢后，即以4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉動物。開胸，將灌注針自心尖插入左心室,并送至主動脈內；剪開右心耳，以生理鹽水灌注沖洗至流出液澄清，用含4%多聚甲醛的0.01 mol/L的PBS灌注固定；取出脊髓腰膨大段(L4～L6)，以4%多聚甲醛液固定48 h，石蠟包埋。將蠟塊沿脊髓行冠狀連續切片(厚4 μm)，兩步法分別進行免疫組化染色，操作步驟參照試劑盒說明書，用PBS代替一抗進行免疫組化陰性對照實驗。每只小鼠分別取抗SP、NK1R、Glu免疫組化染色切片各3張，顯微鏡下黃色/棕黃色/褐色表達于胞質為陽性表達。采用Olympus圖像采集系統，IPP 6.0圖像分析軟件于10×20倍測定脊髓背角淺層(Ⅰ、Ⅱ板層，Rexed 分層法)SP、NK1R、Glu免疫反應陽性的平均光密度值(AOD)。

2 結果

2.1 各組扭體行為比較 PK組出現扭體反應6只(60%)，NK組和對照組均未出現；PK組扭體反應發生率高于對照組和NK組(P均<0.05)，對照組和NK組差異無統計學意義。

2.2 各組疼痛評分比較 PK組疼痛評分(0.88 ± 1.15)分，NK組和對照組均為0分；PK組疼痛評分高于對照組和NK組(P均<0.05)，對照組和NK組差異無統計學意義。

2.3 各組脊髓背角組織中SP、NK1R、Glu表達情況比較 PK組脊髓背角組織中SP、NK1R、Glu表達量高于對照組和NK組(P均<0.05)，對照組和NK組差異無統計學意義。見表1。

表1 各組脊髓背角組織中SP、NK1R、Glu表達情況比較

2.4 各組下丘腦組織中SP、Glu含量比較 PK組下丘腦組織中SP、Glu含量高于對照組和NK組(P均<0.05)，對照組和NK組差異無統計學意義。見表2。

表2 各組下丘腦組織中SP、Glu含量比較

3 討論

臨床經常遇到急救、患者過多或其他不可預估因素等情況，需過急配制立即補鉀。本實驗模擬此類狀況臨用前配制氯化鉀氯化鈉注射液即PK注射液，并即刻取用。

鉀離子是一種致痛因子，輸液時可作用于血管神經末梢感受器，引起疼痛感，局部濃度越高疼痛感越強。臨床用氯化鈉注射液稀釋氯化鉀降低鉀離子濃度以減輕鉀離子所致的疼痛反應，其原因為鈉離子進入細胞并激活Na+-K+-ATP酶，使神經元超極化，抑制后續興奮的發生，從而減少疼痛的產生[4]。NK注射液是四川奇力制藥有限公司參考美國及歐盟藥典標準研制出的供靜脈注射專利產品，采用原子吸收光譜技術嚴格控制成品鉀及鈉離子的濃度配比的成品。 本實驗疼痛行為學結果顯示，NK注射液較PK注射液能明顯減少或減輕藥物引起的動物疼痛反應。其機制或與以下因素有關：①NK注射液采用專利工藝處理，其生產過程中過濾、溶液配制、溫度控制等均采用高精度設備，使成品溶液中離子濃度更精準；滲透壓、pH值等溶液屬性也嚴格符合國家藥典標準，處于適宜范圍。②臨用前過急配制應用的PK注射液，存在局部鉀離子未完全達到均一的可能，從而增加鉀離子刺激所致疼痛；而NK注射液經過標準化生產過程，溶液均一穩定，鈉鉀離子分布更均勻。

SP是前速激肽原A基因編碼的十一氨基酸多肽，屬速激肽家族[5]。SP廣泛分布于中樞和外周神經系統。在外周神經系統中，SP主要表達在傷害性感覺神經元上，參與外周傷害性刺激信息向脊髓背角的傳遞[6]。SP的生物學功能是通過結合SP受體實現的，SP受體又稱速激肽受體(NKRs)，包括NK1R、NK2R、NK3R，均屬于G蛋白偶聯受體[7]。其中，SP作為天然配體與NK1R的親和力最高[8]。NK1R在脊髓的每一層都有表達，在脊髓背角Ⅰ層含量最高[9]。當受到傷害性刺激時，SP一方面通過背根節神經元的周圍突向外周釋放，引起神經炎；另一方面，SP沿背根節神經元的中樞突運輸至中樞[10]，主要存在于脊髓背角Ⅰ、Ⅱ層。下丘腦是調節內臟活動和內分泌活動的高級中樞所在，也是SP的主要分布部位。Glu是中樞神經系統最主要的興奮性神經遞質，興奮性氨基酸能神經元及突觸在中樞神經系統分布廣泛，但主要集中于海馬、大腦皮質淺層和脊髓的膠狀質，對痛信號傳導至關重要[11]。脊髓背角內由后根初級傳入纖維形成的突觸絕大多數是Glu能的，其可引起背角神經元興奮，是一種對傷害性感受傳遞和敏化的關鍵遞質[12]。已有許多研究報道認為，Glu、SP、NK1R含量或表達升高與疼痛或痛敏的發生有關[13～18]。本研究顯示，NK注射液疼痛信息傳遞物質SP、NK1及Glu較PK注射液表達減少，這或許是實驗中NK注射液較PK注射液所致疼痛減少、減弱的機制。

臨床常需靜脈補鉀，NK注射液較PK注射液有以下優勢：從用藥操作方面，NK注射液無需配制，節省時間及人工成本；從用藥安全方面，NK注射液可避免因配制可能出現的錯配或離子配比、滲透壓、pH值等改變超出質量要求范圍等；從藥物經濟學方面，NK注射液與PK注射液費用基本相同。隨著人們對醫療質量要求的逐漸提高以及經濟的發展，NK注射液替代PK注射液的補鉀方式應會是趨勢。