十溴聯苯醚對血腦屏障體外模型通透性的影響

單雅楠，王舒寧，董柏茹，吳潔

錦州醫科大學公共衛生學院，遼寧錦州121001

多溴聯苯醚(PBDEs)是一類具有阻燃特性的化學物，廣泛用于家具、塑料、電子產品、油漆、紡織品以及建筑材料中。由于非共價結合于其他材料，PBDEs容易釋放入環境，經食物鏈進入生物體內而在富含脂質的組織中長期蓄積，在人體內的半衰期可達2～7年[1,2]。由于PBDEs兼具內分泌干擾作用和神經毒性，其生物累積在整個生命進程中的多種結局備受關注[3]。盡管與低溴同系物相比，十溴聯苯醚(BDE-209)通過血腦屏障的能力較差，但發育期暴露所致學習與記憶缺陷、膽堿能系統紊亂和突觸發育關鍵蛋白改變均已在動物實驗證實[4～6]。血腦屏障的功能首要在于腦微血管內皮細胞間的緊密連接，緊密連接蛋白claudins、occludin均是緊密連接的組成成分。研究表明，PBDEs結構與毒性類似物多氯聯苯可引起小鼠腦緊密連接蛋白表達改變，破壞腦微血管內皮細胞完整性[7]，從而促進其中樞神經系統毒性；但是，PBDEs對血腦屏障的作用目前尚不清楚。2018年3～9月，我們采用腦微血管內皮細胞與星形膠質細胞共培養建立血腦屏障體外模型，觀察BDE-209對血腦屏障通透性的影響，以探討PBDEs可能的神經毒性機制。

1 材料與方法

1.1 材料 BDE-209(99%，Alfa Aesar)；小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3(ATCC，CRL-2299)，DMEM高糖培養液、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA (Gibco)；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(杭州欣友生物)，辣根過氧化物酶(HRP，Sigma)，TMB顯色液(碧云天生物)；兔抗occludin抗體(Zymed，Thermo)，小鼠抗GAPDH抗體(Proteintech)，BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/小鼠二抗(北京鼎國)。酶標儀(Bio Tek)，ERS-2電阻儀(Millipore)，Transwell(孔徑0.4 μm，Corning)，低溫高速離心機(Sigma)，超聲波細胞粉碎機(寧波新芝)，垂直電泳槽、轉印槽(北京凱元信瑞)，Tanon 5200全自動化學發光成像分析系統(上海天能)。

1.2 血腦屏障體外模型的建立

1.2.1 bEnd.3細胞培養 按照ATCC推薦的培養方法進行，培養基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，消化液為0.25%胰酶與0.03%EDTA(W/V)。

1.2.2 星形膠質細胞原代培養與傳代 取出生48 h內的健康Wistar胎鼠(錦州醫科大學實驗動物中心)，乙醇浸泡消毒后取腦；解剖顯微鏡下取雙側大腦皮質，冰上D-Hanks液洗2次；剪碎后加入0.125%胰酶，于37 ℃恒溫水浴中消化15 min；以1 500 r/min離心8 min，沉淀中加入含10%馬血清的DMEM培養液；200目篩網過濾，將懸液接種至細胞培養皿，于37 ℃、5% CO2培養箱培養；每2 d全量換液，6～7 d傳代。取第3代細胞，用免疫熒光細胞化學法檢測膠質纖維酸性蛋白(GFAP)鑒定星形膠質細胞，結果顯示純度達90%以上，可用于非接觸共培養模型的構建。

1.2.3 共培養模型構建 用鼠尾膠原包被Transwell，以0.006 mol/L乙酸稀釋鼠尾膠原至100 μg/mL，包被濃度6～10 μg/cm2(12孔，1.12 cm2，80～100 μL)；超凈臺內室溫放置1 h，PBS洗3次直接使用(單層內皮細胞)。星形膠質細胞接種于下室3 d后，將bEnd.3細胞以2×105/mL接種于鼠尾膠原包被的Transwell(PET膜，孔徑0.4 μm，12孔)嵌套中；每天觀察細胞融合狀態，融合后的內皮-膠質細胞非接觸共培養模型即為血腦屏障體外模型。

1.3 血腦屏障體外模型的評價 采用ERS電阻儀測定單層內皮細胞及其與膠質細胞非接觸共培養模型的跨內皮細胞電阻值(TEER)，以無細胞的培養池作為對照，測定培養第2、3、4、5天時內皮細胞TEER。TEER(Ω·cm2)=(TEER測定-TEER對照)×S(膜面積)。TEER在100～140 Ω·cm2，即可判斷為模型構建成功[8,9]。培養不同時間內皮細胞TEER差異有統計學意義(F=87.546，P<0.001)，第4天TEER值可達到110 Ω·cm2。因第3天時非接觸共培養模型與單層內皮細胞TEER即出現顯著差異(t=5.170，P=0.002)，故后續實驗選擇第3天即接種后48 h給予處理因素并作用24 h。見圖1。

注：與同類細胞第2天比較，*P<0.05；與單層內皮細胞同時點比較，#P<0.05。

1.4 BDE-209作用濃度的確定 采用CCK-8檢測bEnd.3細胞活性。將bEnd.3細胞懸液接種于96孔板，(1～2)×104/孔(100 μL)，每組4個復孔，37 ℃培養48 h；加入0、10、25、50、100 μmol/L的BDE-209，繼續培養24 h；吸除培養液，加入含10% CCK-8的DMEM，37 ℃培養2 h，測定450 nm波長處測定吸光度(A450)值。細胞活性(%)=實驗孔A450/對照孔A450×100%。0、10、25、50、100 μmol/L的BDE-209作用24 h，bEnd.3細胞活性分別為100%±0.95%、97.85%±1.40%、92.90%±1.80%、84.25%±2.13%、65.38%±1.76%。100 μmol/L時細胞活性低于80%，故后續實驗以50 μmol/L作為BDE-209最大劑量。

1.5 BDE-209染毒后血腦屏障體外模型通透性觀察 將0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用于血腦屏障體外模型中的bEnd.3細胞24 h，然后從不同指標觀察其通透性變化。

1.5.1 TEER 采用ERS電阻儀測定TEER，方法參照1.3。

1.5.2 滲透情況 采用HRP滲透實驗。將含2 μg/mL HRP的DMEM培養液加入Transwell嵌套內，培養板孔內添加不含示蹤劑的DMEM培養液，保持細胞內外液面相平；60 min后從培養板孔中取50 μL液體接種96孔板，每孔加100 μL TMB底物顯色30 min；加1 mol/L H2SO4終止反應后，在450 nm波長處測定A450。HRP滲透=實驗孔A450/對照孔A450。HRP滲透越多，表示血腦屏障通透性越高。

1.5.3 緊密連接蛋白 采用Western blotting法。提取細胞全蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量；將樣品調至相同濃度，95 ℃煮沸5 min變性，冰上冷卻。取總量相同蛋白，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白；濕轉至PVDF膜(Millipore，0.45 μm)，5%脫脂奶粉-TBST封閉1 h；加入兔抗occludin一抗(1∶1 000)或小鼠抗GAPDH一抗(1∶5 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜10 min×3次，ECL發光法顯影。采用Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白與內參灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 BDE-209對血腦屏障體外模型TEER的影響 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血腦屏障體外模型TEER分別為(119.840±3.542)、(105.280±4.089)、( 91.280±4.967)、(72.240±1.940)Ω·cm2。隨著BDE-209濃度增加，TEER逐漸下降(F=114.232，P<0.001)。

2.2 BDE-209對血腦屏障體外模型HRP滲透的影響 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血腦屏障體外模型HRP滲透分別為1.030±0.034、1.351±0.042、1.871±0.032、2.676±0.063。隨著BDE-209濃度增加，HRP滲透逐漸增多(F=103.625，P<0.001)。

2.3 BDE-209對血腦屏障體外模型中bEnd.3細胞occludin蛋白表達的影響 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血腦屏障體外模型中bEnd.3細胞occludin蛋白表達量分別為0.572±0.064、 0.478±0.059、0.321±0.067、0.268±0.039。隨著BDE-209濃度增加，occludin蛋白表達量逐漸降低(F=17.291，P=0.001)。

3 討論

血腦屏障是由腦毛細血管內皮細胞彼此緊密相連，同時與周細胞和星形膠質細胞相互作用形成的屏障系統，控制營養物質轉運和中樞神經系統內環境穩態[10]。研究表明，PBDEs在脊椎動物腦中蓄積最高的為魚類，其次是青蛙，哺乳動物和鳥類腦中蓄積相對較低，這可能與脊椎動物物種血腦屏障的演變有關[11]。但寵物貓腦中呈現較高濃度的BDE-209和BDE-207，提示其可通過血腦屏障[12]。

腦微血管內皮細胞間的緊密連接是血腦屏障的功能基礎和特征結構，常用跨膜電阻作為緊密連接程度的主要指標[13]。星形膠質細胞終足覆蓋約99%血管表面，對維持微血管內皮細胞的特異性和血腦屏障的完整性起到重要作用[14]。腦微血管內皮細胞-星形膠質細胞非接觸共培養模型中，兩種細胞的相互作用能增強前者胞間緊密連接和轉運體的表達，誘導細胞極性的產生，促進其表現型更接近于體內狀態；與單層內皮細胞相比，共培養模型能觀察到高跨膜電阻和通透性指示劑的低滲透性[15]。永生化小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3具有腦微血管內皮細胞的屏障特性，可表達高濃度緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1[16]。本研究采用bEnd.3與大鼠星形膠質細胞共培養建立的血腦屏障體外模型，在第4天TEER值可達100 Ω·cm2以上，屏障特性趨于穩定，模型建立成功。

腦血管內皮細胞間通過緊密連接和黏附連接嚴格限制了細胞旁運輸[14]。緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白(claudins、occludin、連接黏附分子JAMs)和與細胞骨架聯動的胞質蛋白(閉鎖小帶ZOs、扣帶蛋白cingulin)。occludin是含有4個跨膜結構域的整合蛋白，主要在上皮細胞及中樞神經系統血管內皮細胞中表達；其在細胞之間形成同源連接，控制細胞間的通透性。occludin缺失的小鼠血腦屏障形態結構正常，但腦中可出現鈣化現象，提示occludin可能參與血腦屏障對鈣離子通透性的調控[17]。與PBDEs構效特征相似的多氯聯苯，可引起緊密連接蛋白claudin-5和occludin的減少和再分布，從而改變血腦屏障完整性[18]。本研究結果表明，BDE-209可使bEnd.3與星形膠質細胞共培養血腦屏障體外模型HRP滲透增多，TEER值下降，occludin蛋白表達水平下調，提示BDE-209可致血腦屏障緊密連接破壞而增高其通透性。

血腦屏障完整性或通透性改變參與多種神經系統疾病病理進程，對于生前和生后發育期血腦屏障結構或功能尚不完善的特點，一方面促進BDE-209進入腦實質，另一方面可能由此造成對血腦屏障的損傷而加重其神經毒性，但具體損傷機制還需進一步研究。