淫羊藿苷對TRAIL誘導膠質母細胞瘤細胞凋亡的影響及其分子機制

施萌婧，臧運華，劉永吉，姜傳武，劉柱

1 山東中醫藥大學，濟南250014；2青島市海慈醫療集團

膠質母細胞瘤(GBM)為被WHO列為Ⅳ級星形細胞瘤，是最常見且具有浸潤性的原發性腦瘤。盡管目前采用了最大限度地安全切除、放療和化療等治療方法，但其易產生耐藥性導致復發。耐藥和復發均與細胞凋亡抑制有關，Caspase-3是細胞凋亡的關鍵蛋白，作為其切割底物PARP可間接反映Caspase-3活性。近年來研究發現，靶向治療可能是GBM治療的一種合理、實用的選擇。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)可選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，是治療GBM最有希望的靶向藥物之一。然而，有證據表明GBM對TRAIL的單一治療完全耐藥[1]。淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿屬淫羊藿的水解產物，最近發現其可以誘導人子宮內膜癌細胞凋亡[2]；并且，研究發現ICA可以通過血腦屏障[3]，使其成為治療GBM的理想候選藥物。因此，這提示我們ICA有可能作為TRAIL誘導GBM細胞凋亡的致敏劑。2018年10月～2019年7月，我們觀察了ICA對TRAIL誘導GBM細胞凋亡的影響，并探討其分子機制，旨在鑒定ICA是否對TRAIL具有致敏作用，為GBM治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料 GBM細胞U87(中度耐藥)和U373(重度耐藥)購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清(FBS)、DMEM培養基購自美國HyClone公司；DT5-3型低速自動平衡離心機(北京時代北利離心機有限公司)；CCK-8試劑盒(日本Wako公司)；流式細胞儀(美國BD公司)，Annexin V-FITC檢測凋亡專用試劑盒(美國BD公司)，磷脂酰絲氨酸(PS，上海經科化學科技有限公司，JKLN001185a)，碘化丙啶(PI,美國Oncogene公司)；Caspase-3 (英國Bioss，Bs-0081R)；PARP單克隆抗體(亞克因生物技術有限公司，ABM0042)；辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG(北京博爾西公司，BHR208)，化學發光試劑(ECL，美國Amersham公司),Image J圖像分析軟件(美國NIH公司,BYS-SS161)；Caspase-3活性檢測試劑盒(比色法，南京凱基生物技術公司)，ELX-800酶標儀(美國BIO-TEK公司,KYLS-216)；Caspase抑制劑z-VAD-fmk (美國Sigma公司)；pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢普諾賽生命科技有限公司，PB180327)。

1.2 細胞培養 將U87和U373細胞接種于含10% FBS的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養。

1.3 TRAIL、ICA作用濃度的確定 將GBM細胞以1×104/孔接種96孔板，加入100 μL培養基中過夜培養；細胞融合后，分別加入不同濃度的TRAIL(0、10、20、50、100、200 ng/mL)或ICA(0、2.5、5、10、20 μmol/L)處理48 h，使用CCK-8試劑盒通過MTT法測定細胞存活率。結果顯示，100 ng/mL TRAIL或20 μmol/L ICA處理48 h后U87細胞存活率降低(P均<0.05)，而U373細胞在此劑量下存活率均未明顯降低，故選擇尚未導致統計學意義的上一濃度即50 ng/mL TRAIL、10 μmol/L ICA作為作用濃度。

1.4 細胞凋亡率測算 將U87和U373細胞各自分成4組：TRAIL組加50 ng/mL TRAIL，ICA組加10 μmol/L ICA，TRAIL+ICA組加50 ng/mL TRAIL+10 μmol/L ICA，對照組加等體積DMSO，處理48 h后采用流式細胞術檢測凋亡細胞。使用Annexin V試劑盒，通過Annexin V-FITC檢測PS的膜外作用來評估被測細胞的凋亡誘導；在處理后不同時間間隔采集2×105個細胞，用PBS洗滌2次，然后在200 μL的Binding Buffer中繼續培養。加入Annexin V-FITC和1 μg/mL PI，并在黑暗環境下孵育15 min；加入300 μL的1×Binding Buffer停止反應，用流式細胞儀分析標記凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.5 細胞中Caspase-3、PARP蛋白檢測 細胞分組與處理同1.4，采用Western blotting法檢測Caspase-3、PARP蛋白。蛋白質經SDS-PAGE電泳分離，電泳轉移到硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉在PBS-Tween-20(0.1%，V/V)中對硝化纖維素膜進行封閉，4 ℃過夜孵育。將該膜與初級抗體(根據制造商的說明書稀釋)孵育2 h，辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG用作第二抗體。ECL顯色，用Image J軟件測量譜帶的光密度。以β-actin為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.6 細胞裂解物中Caspase-3活性檢測 細胞分組與處理同1.4，采用比色測定法測量細胞裂解物中的Caspase-3活性。將1×106個細胞用PBS充分洗滌，重懸于50 μL裂解緩沖液中，在冰浴中孵育60 min。將溶液以10 000 g離心1 min，收集上清液；在37 ℃下與酶特異性比色底物孵育4 h，用ELISA酶標儀在405 nm波長下測定比色產物。

1.7 Caspase在ICA對TRAIL誘導GBM細胞凋亡中的作用觀察 將兩種細胞隨機分為4組：阻斷組和阻斷處理組先予以Caspase抑制劑z-VAD-fmk(25 μmol/L)預處理4 h后再分別加DMSO、TRAIL+ICA，對照組和處理組不預處理分別加DMSO、TRAIL+ICA，ICA、TRAIL作用濃度分別為10 μmol/L、50 ng/mL。處理48 h后采用流式細胞術測算細胞凋亡率，方法同1.4。

2 結果

2.1 ICA對TRAIL誘導GBM細胞凋亡的影響 TRAIL+ICA組細胞凋亡率高于對照組、ICA組、TRAIL組(P均<0.05)，對照組、ICA組、TRAIL組兩兩比較差異均無統計學意義。見表1。

表1 ICA對RAIL誘導GBM細胞凋亡的影響

2.2 ICA對TRAIL誘導GBM細胞中Caspase-3、PARP蛋白表達的影響 TRAIL+ICA組細胞中Caspase-3、PARP蛋白表達量高于對照組、ICA組、TRAIL組(P均<0.05)，對照組、ICA組、TRAIL組兩兩比較差異均無統計學意義。見表2。

表2 ICA對TRAIL誘導GBM細胞中Caspase-3、PARP蛋白表達的影響

2.3 ICA對TRAIL誘導GBM細胞裂解物中Caspase-3活性的影響 TRAIL+ICA組細胞裂解物中Caspase-3活性高于對照組、ICA組、TRAIL組(P均<0.05)，對照組、ICA組、TRAIL組兩兩比較差異均無統計學意義。見表3。

表3 ICA對TRAIL誘導GBM細胞裂解物中Caspase-3活性的影響

2.4 Caspase在ICA對TRAIL誘導GBM細胞凋亡中的作用 處理組細胞凋亡率高于對照組、阻斷組、阻斷處理組(P均<0.05)，對照組、阻斷組、阻斷處理組兩兩比較差異均無統計學意義。見表4。

表4 Caspase在ICA對TRAIL誘導GBM細胞凋亡中的作用

3 討論

GBM是一種主要發生于成年人的原發性腦腫瘤，具有高致死率和侵襲性的特點，患者中位生存期約為14.6個月。研究發現，GBM的異質性是其治療難度高于其他腫瘤的原因之一[4]。動物體內研究發現，人類TRAIL可以抑制異種移植小鼠體內GBM的生長，具有作為抗腫瘤藥物的潛力[5]。

細胞死亡為細胞膜完整性的不可逆喪失，根據形態學標準可分為凋亡、自噬和壞死3種類型[6]。細胞凋亡是由細胞內死亡程序激活而引發的程序性細胞死亡。越來越多的證據表明，誘導腫瘤細胞凋亡是一種有效的癌癥治療策略。然而，GBM細胞對凋亡刺激表現出極強的抵抗性[7]。此外，有研究表明，GBM干細胞(GSCs)具有極強的抗化療和抗輻射能力，并能促進腫瘤的生長和發展，加劇了GBM的抗凋亡性[8,9]。本研究也發現，100 ng/mL TRAIL處理48 h后U87細胞存活率降低，而U373細胞在200 ng/mL劑量下存活率未明顯降低；這與先前的研究一致，即U87細胞對TRAIL是中度耐藥，而U373細胞是顯著耐藥的[10]。因此，開發新的治療方案，克服分化的腫瘤細胞和GSCs對凋亡刺激的抵抗，是保證腫瘤徹底根除的必要條件。然而，已知大多數GBM細胞對TRAIL存在抵抗[11]，這在很大程度上限制了TRAIL的臨床應用。

近10年來，許多研究都強調了TRAIL與另一種抗腫瘤藥物聯合治療以克服GBM對TRAIL耐藥性的可行性。臨床前研究表明，TRAIL和替莫唑胺可延長GBM異種移植小鼠的生存期[12]。TRAIL在與腫瘤細胞上的死亡受體TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)結合后[13]，募集死亡受體結構域鏈接蛋白(FADD)到受體上，再通過FADD中的死亡效應結構域(DED)募集起始Caspase(pro-Caspase-8/10)到受體復合物上，形成死亡誘導信號復合體(DISC)。pro-Caspase-8/10在DISC中自我活化，形成活性Caspase-8/10并釋放到細胞質中，激活下游Caspase信號級聯誘導細胞凋亡[10,14]。而Caspase-3處于細胞凋亡的級聯反應途徑中的核心位置，凋亡信號傳導通路中的關鍵環節就是激活Caspase-3并促進其表達。在腦缺血/再灌注損傷中，Caspase-3在神經細胞損傷的病理過程中發揮著重要作用。Le等[15]研究發現，與對照組相比，Caspase-3基因缺乏的缺血/再灌注大鼠模型，皮層梗死的體積減少55%，凋亡細胞數減少36%。這說明Caspase-3參與了神經細胞凋亡的病理過程，抑制了Caspase-3的表達，并且能減輕神經損傷及神經細胞的凋亡。PARP是Caspase-3的切割底物，也是Caspase-3激活的標志。Caspase-3被激活后構象發生改變形成剪切體Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-3進一步剪切PARP，使總PARP減少、Cleaved PARP增加，導致PARP失去正常功能，最終使得核小體間DNA降解、細胞發生凋亡[16]。

近期，有報道稱一些天然化合物能使GBM細胞在體外對化療產生敏感性[17]。淫羊藿是傳統中藥，具有溫補腎陽、祛風除濕的功效，在臨床中應用廣泛。經查閱文獻，我們發現ICA具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，并可以通過血腦屏障，使其成為TRAIL增敏作用的理想候選藥物。本研究結果顯示，與對照組、ICA組、TRAIL組比較，TRAIL+ICA組細胞凋亡率增高，細胞中Caspase-3、PARP蛋白表達量增加，細胞裂解物中Caspase-3活性增強；對照組、ICA組、TRAIL組兩兩比較，差異均無統計學意義；處理組細胞凋亡率高于對照組、阻斷組、阻斷處理組，對照組、阻斷組、阻斷處理組兩兩比較差異均無統計學意義。以上結果表明，ICA通過Caspase依賴性方式促進TRAIL誘導的GBM細胞凋亡。我們認為，ICA與TRAIL合用是一種有效的凋亡復合物，可為GBM的治療提供有效策略。但是，由于體內細胞凋亡過程十分復雜，尚需進一步進行動物實驗以驗證其有效性。