Wnt3a對子宮內膜癌細胞轉移的影響及其分子機制

劉晶晶，劉海娟，王榮

1 西安市第四醫院，西安710075；2 西安交通大學基礎醫學院

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，臨床治療有手術、放療、化療或激素等方法，但仍有15%～20%的患者出現轉移[1]，然而轉移灶的治療手段有限導致患者預后極差[2]。因此，闡明與轉移級聯相關的信號通路是開發新的有效治療方法的關鍵目標。Wnt3a作為Wnt家族最具代表性的信號蛋白，是經典Wnt信號通路的主要配體，其分布廣泛。研究發現，Wnt3a在腫瘤發生和轉移中起著復雜的作用。例如：Wnt3a生長因子誘導雄激素受體介導的轉錄并促進前列腺癌細胞生長[3]，CSF-1R通過Wnt3a信號促進非小細胞肺癌細胞的轉移[4]，miR-214靶向Wnt3a抑制肝癌細胞增殖[5]，MiR-195靶向Wnt3a抑制結腸癌的增殖和轉移[6]，Glypican-5通過與Wnt3a競爭性結合抑制肺腺癌的上皮-間質轉化[7]，但Wnt3a在子宮內膜癌中的作用和機制尚不清楚。Dishevelled-2(Dvl-2)蛋白是Wnt信號通路中關鍵的信號蛋白分子，而PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt信號傳導中起著重要而復雜的作用。2019年3～11月，我們觀察了Wnt3a對子宮內膜癌細胞轉移的影響，并探討其是否通過Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β通路起作用，為進一步闡明其在子宮內膜癌中發揮的調控作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人子宮內膜癌細胞Ishikawa購自上海生物細胞研究所。DMEM培養基為北京索萊寶科技有限公司產品，超敏ECL化學發光試劑盒為ZATA公司產品，TurboFect 轉染試劑為中國賽默飛世爾科技公司產品，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase cDNA Synthesis Kit均購于大連Takara公司；預染蛋白Marker為北京康為世紀生物科技有限公司產品，山羊抗兔IgG(H+L)-HRP、山羊抗鼠IgG(H+L)-HRP購自杭州聯科生物技術股份有限公司，兔源GAPDH抗體為北京博奧森生物技術有限公司產品；PI3K抑制劑LY294002、Akt抑制劑CCT128930、GSK3β抑制劑AR-A014418購自美國Selleck生物科技公司；PI3K-Akt信號通路激活劑IGF-1購自購自上海碧云天生物有限公司；PI3-kinase p110γ抗體購自上海圣克魯斯生物公司，p-AKT、GSK3β、Dvl-2抗體購自英國Abcam公司，siRNA NC、Dvl-2 siRNA質粒由北京擎科生物有限公司合成。

1.2. 細胞培養 將Ishikawa細胞接種于含10% FBS的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養；待細胞長滿后，按相應數量分別接種于培養皿或培養板中。

1.3 Wnt3a影響細胞活性觀察 采用MTT法檢測細胞活力。將Ishikawa細胞以1×105/mL接種96孔板，細胞融合度達70%～80%時，分別加入0、100、200、400、500 ng/mL Wnt3a，每濃度設5個復孔，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h；用PBS洗3次，每孔加50 μL MTT，繼續培養4 h；去上清，每孔加150 μL DMSO，低速振蕩10 min，在酶標儀上讀取各孔在570 nm處的吸光值。結果顯示，Wnt3a<500 ng/mL時對細胞生長活性沒有影響，而500 ng/mL時細胞生長活性顯著降低，因此選用400 ng/mL以內的Wnt3a用于遷移實驗。

1.4 Wnt3a影響細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。待細胞融合度達95%時制成單細胞懸液，以3×105/孔接種于6孔板；顯微鏡下觀察細胞貼壁后，用100 μL槍頭垂直于孔板行細胞線性劃痕，PBS洗去細胞碎片；加入無血清培養基或含50、100、200、400 ng/mL Wnt3a的DMEM培養基，分別于劃痕即刻(0 h)、劃痕后48 h用顯微鏡觀察并拍攝細胞劃痕照片，用Image J分別計算0 h、48 h的細胞遷移距離。細胞遷移距離=0 h的細胞劃痕距離-48 h的細胞劃痕距離。

1.5 Wnt3a影響Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性觀察 將Ishikawa細胞以1×105/mL接種6孔板，細胞融合度達70%～80%時加400 ng/mL Wnt3a，分別于處理0、12、24、48 h收取細胞；采用Western blotting法檢測Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性，按試劑盒說明書操作。以GAPDH為內參，以磷酸化目標蛋白與目標蛋白比值表示其活性。

1.6 Dvl-2在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用觀察 將細胞以1×105/孔接種12孔板，細胞融合度達75%時分為對照組和阻斷組，分別用Tubfect轉染試劑轉染siRNA NC、Dvl-2 siRNA質粒；轉染48 h后收集各細胞，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測Dvl-2基因。引物序列：Dvl-2上游為5′-GUGAGAGCUACCUAGUCAATT-3′，下游為5′-CGCUAAACAUGGAGAAGUATT-3′；內參GAPDH上游為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游為5′- CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。反應條件：95 ℃反應15 min；95 ℃作用15 s，60 ℃反應1 min，45個循環。融解曲線 55～95 ℃，每分鐘升高0.5 ℃，采用2-ΔΔCt法分析定量結果。結果顯示，阻斷組Dvl-2基因表達量為0.45±0.27，低于對照組的1.08±0.64(P<0.05)，提示轉染成功。將轉染Dvl-2 siRNA的細胞分為阻斷處理組和阻斷對照組，轉染siRNA NC的細胞分為對照處理組和對照組，均分別加或不加400 ng/mL Wnt3a處理48 h，按1.4的方法觀察細胞遷移能力。

1.7 細胞中Wnt3a與Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路的調控關系分析 ①取轉染siRNA NC、Dvl-2 siRNA質粒的Ishikawa細胞，分組處理同1.6，采用Western blotting法檢測PI3K活性，方法同1.5。②取未處理的Ishikawa細胞，細胞分組與處理同1.6，僅阻斷處理組和阻斷對照組均預先加PI3K抑制劑LY294002(25 μmol/L)處理1 h；采用Western blotting法檢測Akt活性，方法同1.5。③取未處理的Ishikawa細胞，阻斷處理組和阻斷對照組均預先加Akt抑制劑CCT128930(50 μmol/L)處理1 h,其后處理方法同1.6；采用Western blotting法檢測GSK3β活性，方法同1.5。

1.8 PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用觀察 將未處理的Ishikawa細胞以1×105/孔接種12孔板，細胞融合度達75%時分為4組；對照組不處理，PI3K阻斷組、Akt阻斷組、GSK3β阻斷組分別先予以PI3K抑制劑LY294002(25 μmol/L)、Akt抑制劑CCT128930(50 μmol/L)、GSK3β抑制劑AR-A014418(25 μmol/L)處理1 h；然后4組分為兩份分別加或不加400 ng/mL Wnt3a處理48 h，按1.4的方法觀察細胞遷移能力。

1.9 Dvl-2調控PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用觀察 將未處理的對數生長期Ishikawa細胞以1×105/孔接種12孔板，細胞融合度達75%時分為7組；對照組不處理，Wnt3a組加400 ng/mL Wnt3a處理，Dvl-2阻斷組轉染Dvl-2 siRNA質粒，通路激活組加PI3K-Akt信號通路激活劑IGF-1(100 ng/mL)，Dvl-2阻斷+通路激活組先轉染Dvl-2 siRNA質粒后加IGF-1(100 ng/mL)，Wnt3a+通路激活組同時加400 ng/mL Wnt3a、IGF-1(100 ng/mL)，Dvl-2阻斷+ Wnt3a+通路激活組先轉染Dvl-2 siRNA質粒后加400 ng/mL Wnt3a、IGF-1(100 ng/mL)；處理48 h后，按1.4的方法觀察細胞遷移能力。

假定機身處于水平或近水平狀態，只存在偏航和橫向偏移，事實上，對于掘進機來說通過控制鏟板和后支撐做到機身基本水平是容易的，在組合式導航系統中，慣性導航系統可以實時檢測機身的橫滾角和俯仰角，用于判斷掘進機是否水平。解算模型如圖2所示，設MN為機身縱向軸線，A、B、C、D分別表示其上表面4個特征點，A、B關于MN對稱，C、D關于MN對稱。

2 結果

2.1 Wnt3a對細胞遷移的影響 用50、100、200、400 ng/mL Wnt3a處理后細胞遷移距離分為(4.25±0.72)、(5.82±0.73)、(6.39±0.91)、(8.92±0.35)mm，均大于未經處理(0 ng/mL Wnt3a)細胞的(3.05±0.28)mm(P均<0.01)，細胞的遷移能力隨Wnt3a濃度升高而升高。

2.2 Wnt3a對細胞中Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性影響 400 ng/mL Wnt3a處理細胞后，隨著作用時間的延長，Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性均逐漸增高，Dvl-2活性24 h最高，PI3K-Akt-GSK3β通路活性48 h最高。見表1。

表1 400 ng/mL Wnt3a處理不同時點細胞中Dvl-2、PI3K-Akt-GSK3β通路活性變化

2.3 Dvl-2在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用 對照處理組細胞遷移距離為(8.92±0.35)mm，大于對照組的(3.05±0.28)mm(P<0.01)；阻斷對照組細胞遷移距離為(2.06±0.57)mm，小于對照組(P<0.05)；阻斷處理組細胞遷移距離為(3.18±0.72)mm，小于對照處理組(P<0.01)。

2.4 Wnt3a通過Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β信號通路 ①細胞中Wnt3a與Dvl-2、PI3K的調控關系：干擾Dvl-2表達，細胞中PI3K活性(p-PI3K/PI3K)對照組處理組(1.52±0.26)>對照組(0.97±0.58)>阻斷對照組(0.23±0.12)、阻斷處理組(0.27±0.38)，P均<0.01。②細胞中Wnt3a與PI3K、Akt的調控關系：干擾PI3K表達，細胞中Akt活性(p-Akt/Akt)對照處理組(1.32±0.72)>對照組(0.45±0.39)>阻斷對照組(0.21±0.26)、阻斷處理組(0.23±0.14)，P均<0.01。③細胞中Wnt3a與Akt、GSK3β的調控關系：干擾Akt表達，細胞中GSK3β活性(p-GSK3β/GSK3β)對照處理組(1.49±0.37)>對照組(0.87±0.56)>阻斷對照組(0.21±0.36)、阻斷處理組(0.17±0.18)，P均<0.01。

2.5 PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用 細胞遷移距離未加Wnt3a的PI3K阻斷組、Akt阻斷組、GSK3β阻斷組<未加Wnt3a的對照組及加Wnt3a的PI3K阻斷組、Akt阻斷組、GSK3β阻斷組<加Wnt3a的對照組，P均<0.05或<0.01。見表2。

表2 阻斷PI3K-Akt-GSK3β通路對Wnt3a促進細胞遷移的影響

2.6 Dvl-2調控PI3K-Akt-GSK3β通路在Wnt3a影響細胞遷移能力中的作用 細胞遷移距離Wnt3a+通路激活組[(17.85±0.95)mm]>Wnt3a組[(8.92±0.35)mm]、通路激活組[(9.83±0.48)mm]>Dvl-2阻斷+通路激活組[(6.03±0.72)mm]、Dvl-2阻斷+Wnt3a+通路激活組[(6.72±0.91)mm]>對照組[(3.05±0.28)mm]>Dvl-2阻斷組[(2.06±0.57)mm]，P均<0.05或<0.01。

3 討論

腫瘤細胞易轉移的特性是導致子宮內膜癌患者治療后復發的關鍵，為了提高生存率，控制腫瘤的侵襲和轉移是很重要的。轉移是一個多步驟的過程，在此過程中，原發性腫瘤中的腫瘤細胞失去細胞之間的黏力，突破基底膜，增加侵襲性，使其循環灌注到遠處的組織，從循環系統中滲出后在遠處定植[8]。有研究表明，Wnt信號通路調節多種生物過程，包括細胞生長、發育、轉移和癌變[9]。近年來，大量研究發現Wnt信號通路通過與腫瘤微環境或其他信號通路相互作用，參與腫瘤細胞侵襲和轉移的調控[10]。Wnt3a是Wnt信號通路的重要組成部分，可以激活下游信號通路。有研究發現，Wnt3a對非小細胞肺癌細胞生長具有促進作用[11]，Wnt3a介導β-catenin/Wnt信號通路激活可促進膠質母細胞瘤的惡化，EBP50通過Wnt3a/β-catenin信號通路可抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移[12]。本研究發現，Wnt3a能夠促進子宮內膜癌細胞的遷移，表明Wnt3a在子宮內膜癌發展過程中具有一定作用。

Dvl蛋白是Wnt信號通路中關鍵的具有高度保守區域的信號蛋白分子，目前發現其具有3種同型異構體,在人的腦、心、肺、腎、骨骼肌等組織中均有表達；并且已有多個研究報道，Dvl在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和肺癌等腫瘤組織中高表達。Dvl-2是該家族中的重要成員之一，定位于17號染色體短臂13區，在3種異構體中其表達量最高(約占80%)。有研究顯示，特異性下調Dvl-2表達可顯著抑制Wnt3a依賴性細胞的形態和運動改變，Wnt通過下調Dvl-2在非小細胞肺癌細胞中表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路[13]。Dvl磷酸化是膜受體激活下游的最近端信號傳導事件，我們研究發現Wnt3a在子宮內膜癌細胞中誘導Dvl-2磷酸化，通過siRNA轉染阻斷Dvl-2信號轉導可阻斷Wnt3a誘導的細胞遷移，提示Dvl-2的激活參與了子宮內膜癌遷移的調控。

研究表明，Wnt5a可能通過誘導肌動蛋白重組和激活蛋白激酶C(PKC)來促進腫瘤的進展[14]，或通過觸發PI3K/Akt信號促進人皮膚成纖維細胞黏附[15]，或通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路調控人卵巢癌SKOV3/VCR細胞對長春新堿的敏感性。Wnt3a通過激活IRS2/PI3K信號調節胰腺癌NIT-1β細胞增殖、凋亡及功能[16]，PI3K-Akt通路介導Wnt3a誘導的成骨細胞分化，Wnt3a和肝素通過激活PI3K/Akt/RUNX2通路協同增強成骨細胞中堿性磷酸酶(ALP)活性[17]。這些結果表明，PI3K/Akt在各種細胞和組織類型的Wnt信號傳導中起著重要而復雜的作用。在本研究中，我們發現Wnt3a在子宮內膜癌細胞中能誘導PI3K、Akt磷酸化，化學抑制阻斷PI3K和Akt阻礙了Wnt3a誘導的細胞遷移，表明PI3K/Akt活化參與了子宮內膜癌細胞遷移的調控。GSK3β可通過Akt介導的途徑在Ser9位點磷酸化參與多種腫瘤的形成[18]。我們的實驗結果表明，Wnt3a顯著提高了子宮內膜癌細胞中GSK3β的磷酸化水平，抑制劑干擾GSK3β功能后明顯抑制了子宮內膜癌細胞的遷移。此外，通過化學抑制Akt可顯著降低Wnt3a誘導的GSK3β磷酸化，提示GSK3β作用于PI3K/Akt的下游；而且干擾Dvl-2表達后，Wnt3a誘導的PI3K磷酸化水平下降，表明Dvl-2是Wnt3a激活PI3K的介導者。

綜上所述，Wnt3a能夠通過Dvl-2激活PI3K-Akt-GSK3β信號通路，從而促進子宮內膜癌細胞的遷移；然而調控機制可能僅僅是一方面，有關Wnt3a、Dvl-2和PI3K-Akt-GSK3β通路之間的關系需要進一步研究，為改善子宮內膜癌患者的臨床預后提供更多的理論依據。