子宮內膜癌預后相關差異表達基因篩選及其生物信息學分析

樂露露，羅吉，吳海芳，傅芬,

1 南昌大學第二附屬醫院，南昌330006；2 南昌大學醫學院

子宮內膜癌(EC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增高，且呈年輕化趨勢[1]。雖然EC的治療取得了長足進步，但患者預后存在一定差異。因此，篩選EC預后生物標志物對于EC的診治具有重要意義。隨著生物信息學、高通量測序技術的應用滲透到臨床研究中，可在線獲得大量患者信息。目前，尚無研究利用該技術篩選EC預后生物標志物。2019年11月，我們從癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達綜合(GEO)數據庫聯合篩選差異表達基因(DEGs)，尋找與EC預后相關的DEGs，并通過基因本體論(GO)功能富集及基因組百科全書(KEGG)通路富集進一步探索該基因的生物學功能，從而為EC診治提供新的生物標志物和分子靶標。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件 數據庫：TCGA數據庫(https://xenabrowser.net/datapages/)；GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)；軟件SPSS22.0(IBM, Chicago, IL, USA)；R3.4.1軟件limma、survival包。

1.2 方法

1.2.1 數據來源 從TCGA數據庫(https://xenabrowser.net/datapages/)下載EC的RNASeq數據和Phenotype數據，包括552例EC標本、23例正常子宮內膜標本；選取其中臨床病理學參數(年齡、月經情況、病理類型、FIGO分期和組織分級)及生存資料完整的病例，最終得到140例。在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中進行檢索，識別截至2019年的EC相關基因表達數據集，GEO檢索式為“endometrial neoplasms”“Homo sapiens”。從GEO數據庫中下載了兩個基因表達譜矩陣文件GSE63678[2]、GSE17025[3]，GSE63678包括7例EC標本和5例正常子宮內膜標本，GSE17025包括91例EC標本和12例正常子宮內膜標本。這兩個數據集的平臺分別是GPL63678和GPL17025，根據平臺上的注釋信息，將探針轉換為相應的基因符號，對所有基因表達數據進行log2轉化。

1.2.2 EC中DEGs的篩選 從TCGA數據庫中下載EC的數據集，使用R軟件limma包中線性模型經驗貝葉斯統計的方法實施非特異性過濾，篩選出癌與癌旁組織的DEGs，并按顯著性排序。從GEO數據庫下載的數據集，經篩選后納入兩個平臺數據(GPL17025和GPL63678)，通過GEO2R驗證TCGA數據集中升降居前十的顯著基因，其中P<0.05和|log(FC)|>1的基因被認為是DEGs。

1.2.3 EC預后相關DEGs的篩選 從TCGA下載的數據集，以各基因表達水平的中位數作為高低表達的截斷值。通過COX回歸和Kaplan-Meier曲線，利用R軟件survival包對DEGs進行總生存期(OS)和無病生存期(DFS)分析。

1.2.4 不同臨床病理參數EC患者預后相關DEGs表達分析 以預后相關DEGs表達水平的中位數將作為區別高低表達的截斷值，采用SPSS22.0統計軟件對比140例EC患者不同臨床病理學參數間預后相關DEGs表達水平差異；計數資料以例表示，不同臨床病理參數間比較行χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.5 EC預后相關DEGs的功能與通路富集分析 使用DAVID數據庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)對確定的DEGs進行GO和KEGG途徑分析，設定P<0.05為截止標準。GO從三個方面描述基因功能：分子功能(MF)、細胞組成(CC)和生物學過程(BP)。

2 結果

2.1 EC中DEGs的篩選結果 TCGA數據庫在20 530個基因中篩選出1 367個DEGs，其中前10個上調和下調基因見表1。通過GEO2R驗證TCGA數據集前10個最顯著基因，結果顯示基因ASPA、MYBL2、TROAP、CCNB2和CDC25C在GEO數據集中均顯著(P均<0.05)。

2.2 EC預后相關DEGs的篩選結果 5個DEGs中，僅MYBL2基因高低表達EC患者OS和DFS差異有統計學意義(P均<0.05)，其余4個DEGs高低表達EC患者OS和DFS差異均無統計學意義。見表2。

表1 TCGA數據集前10個上調和下調基因

表2 DEGs高低表達EC患者OS和DFS比較

2.3 不同臨床病理參數EC患者MYBL2基因表達水平比較 Ⅱ型(基因突變相關型)、組織低分化EC患者MYBL2基因高表達比例分別高于Ⅰ型(雌激素依賴型)、低分化患者(P均<0.05)，不同年齡、月經情況、臨床分期EC患者MYBL2基因高表達比例差異無統計學意義。見表3。

2.4 MYBL2的GO和KEGG富集分析結果 GO功能富集結果顯示，MYBL2基因在BP層面主要參與細胞代謝、生物調節等過程，在CC層面主要參與細胞膜、細胞核、大分子復合物等的形成，在MF層面主要參與蛋白結合、核酸結合、核苷酸結合等。KEGG信號通路富集分析結果顯示，MYBL2基因與癌癥途徑(49個，P=1.93E-04，FDR=1.01E-02)、癌癥的蛋白聚糖(33個，P=1.36E-05，FDR=1.76E-03)、細胞周期(24個，P=9.20E-06，FDR=1.76E-03)、細胞凋亡(22個，P=5.23E-04，FDR=1.76E-02)和人類T淋巴病毒感染(34個，P=5.81E-04，FDR=1.76E-02)通路有關。

表3 不同臨床病理參數EC患者MYBL2基因表達水平比較(例)

3 討論

EC是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，多見于絕經后婦女，但有15%～25%在更年期前確診。絕經后EC大多數是Ⅰ型，對雌激素依賴性增加，預后良好，該型占EC的70%～80%[4]。相比之下，Ⅱ型EC一般預后較差。手術是絕經后EC的主要治療方法，但Ⅱ型患者5年內復發率仍為10%～15%，再治療效果差且生存時間短[5]。因此，迫切需要發現新的可靠的臨床檢測標志物，用于EC的早期診斷和預后預測。

TCGA是目前最大的癌癥基因數據庫，GEO也是當今最大、最全面的公共基因表達譜數據庫，兩者為研究癌癥基因提供了大量的科學依據。本研究聯合兩個數據庫共篩選出5個DEGs，僅MYBL2基因高低表達EC患者OS和OFS差異有統計學意義，即MYBL2基因高表達者OS和DFS更短、預后更差。因此，最終篩選出目標基因MYBL2為預后預測基因。

原癌基因MYBL2，又稱B-MYB，是轉錄因子MYB家族中的一員，該家族還包括A-MYB和C-MYB。A-MYB主要在睪丸中表達，在卵巢、脾臟和大腦中表達極低；C-MYB在造血干細胞、大腦、結腸中高表達。MYBL2是MYB轉錄因子家族的高度保守成員，通常在快速分裂的細胞中表達，特別是在成年造血和胚胎干細胞中表達，參與多種腫瘤細胞的增殖、分化與凋亡[6，7]。MYBL2的表達失調可能與chr20q13擴增有關，該染色體區域擴增導致MYBL2增高均已在乳腺癌、卵巢癌證實[8,9]，提示MYBL2在腫瘤的發生發展中起重要作用。然而，MYBL2在EC中的表達及其生物學功能尚不清楚。

研究顯示，MYBL2在增殖期細胞內高表達，敲除該基因的小鼠可因囊胚內細胞集落形成受阻皆于胚胎早期死亡，表明MYBL2是調控細胞周期、細胞存活的重要基因[10]。在G0期，MYBL2被限制在由DP、類RB蛋白、E2F和MuvB構成的磷酸化DREAM復合體中，其表達甚微；當G1期中的CCNA/E-CDK2復合體將MuvB去磷酸化后，DREAM復合體解離，釋放出E2F后與MYBL2區啟動子結合，正向調控MYBL2表達；后者不僅使細胞克服G1期阻滯，加速進入S期，而且能直接結合G2/M期基因啟動子上的MYB結合位點，激活相關基因表達，幫助細胞越過G2期檢查點，促進細胞增殖[11,12]。

最近研究表明，MYBL2在多種癌癥組織中過表達[13～16]，并且MYBL2可能具有作為預測預后生物標志物和治療靶標的潛力[13,17]。本研究結果顯示，組織低分化、Ⅱ型EC患者MYBL2基因高表達比例分別高于高分化、Ⅰ型，MYBL2基因高表達者OS和DFS更短、預后更差。這提示MYBL2在EC發生發展中起重要作用，MYBL2高表達可能為EC不良預后因素之一。為進一步探討MYBL2在EC中的分子機制，我們進行了GO和KEGG富集分析；GO功能富集分析表明，MYBL2分子功能主要在細胞代謝、細胞膜、蛋白結合富集；KEGG通路分析表明，MYBL2主要富集于5個途徑，即細胞周期、細胞凋亡、人類T淋巴病毒感染、癌癥的蛋白聚糖、癌癥途徑。眾所周知，EC源于子宮內膜的異常生長，以上結果證明了MYBL2可能影響子宮內膜的增殖和凋亡的推測。

綜上所述，本研究確定了MYBL2為EC預后有關DEGs，可以作為EC治療的分子靶標和診斷生物標志物。但是，我們的研究有一定局限性：首先，本發現完全基于使用生物信息學分析的公共數據庫，因此需要進行功能實驗來驗證這些結果；其次，預后預測價值僅基于單個隊列且樣本量相對較小，因此應進行較大獨立隊列的研究以驗證本文結論。