長鏈非編碼RNA SCARNA10對肝癌細胞增殖的影響及其機制

韓亞偉，崔冉亮，李悅國

天津醫科大學腫瘤醫院 國家腫瘤臨床醫學研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室 天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年升高[1]。盡管在防治方面已取得很大改善，但肝癌患者的長期生存情況仍然不佳[2]。分子靶向治療是腫瘤治療的新手段，在分子水平研究肝癌的發病機制有助于尋找相應靶標，提高肝癌的診治效果[3,4]。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質的RNA，近年研究表明其在多種生理病理過程中發揮重要調控作用[5,6]。其中，長鏈非編碼RNA(lncRNA)異常表達可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學功能，從而促進或抑制腫瘤的形成[7,8]。研究表明，lncRNA在細胞中核質分布不同，其發揮作用的機制不同；PRC2是一種多梳家族蛋白，主要分布在細胞核中，具有組蛋白甲基轉移酶活性，而SUZ12、EZH2在PRC2功能發揮中起重要作用。本課題組前期研究表明lncRNA SCARNA10能夠促進肝纖維化進展[9]，且有報道發現其在肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤組織中異常表達[10,11]。2019年8月～2020年6月，我們觀察了SCARNA10在肝癌細胞中的表達及對細胞增殖的影響，并探討其可能的機制，為肝癌的早期診治提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細胞：人肝癌細胞HepG2、MH97H及人正常肝細胞L-7702均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。主要試劑：DMEM、Opti-MEM及FBS購自美國Gibco公司；轉染試劑Lipofectamine2000購自蘇州宇恒生物科技有限公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；引物合成自蘇州金唯智生物科技有限公司；SCARNA10小干擾RNA(siRNA)及陰性對照RNA(NC)均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成?？贵wSUZ12(ab12073)、EZH2(ab3748)均購自英國Abcam公司；抗體IgG(PP64B)購自美國Millipore公司。

1.2 肝癌細胞與正常肝細胞中SCARNA10表達檢測 采用實時熒光定量PCR(qPCR)法。將HepG2、MH97H及L-7702細胞接種于含10% FBS的DMEM培養基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。取對數生長期細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA；分光光度計檢測RNA濃度及純度，光密度(OD260/280)1.8～2.1為合格的RNA樣本。取1 μg總RNA逆轉錄為cDNA，進行qPCR檢測。引物序列：SCARNA10上游引物為5′-GTTTGGCTAAGCCCAGGGAC-3′，下游引物為5′-GTTGGTCTGCCCTTACAGTGA-3′；β-actin上游引物為5′-GCCGGGACCTGACTGACTAC-3′，下游引物為5′-TTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算SCARNA10相對表達量。

1.3 SCARNA10對肝癌細胞增殖影響的觀察

1.3.1 細胞轉染 轉染前1 d將HepG2、MH97H細胞置于6孔板中培養，第2天細胞融合度達60%左右時進行轉染。用Opti-MEM分別孵育siRNA、NC及Lipofectamine2000，并靜置5 min。將Lipofectamine2000與Opti-MEM混合液分別加入siRNA與NC中，混勻后靜置20 min。之后分別加入到HepG2、MH97H細胞中，轉染36 h收集細胞。采用qPCR法檢測細胞中的SCARNA10，方法同1.2；結果顯示，轉染siRNA的肝癌細胞中SCARNA10表達低于轉染NC的細胞(P均<0.05)，提示轉染成功。

1.3.2 細胞增殖能力觀察 ①qPCR法：收集轉染后的肝癌細胞，提取RNA；逆轉錄后，進行qPCR檢測增殖細胞核抗原(PCNA)。PCNA上游引物為5′-TCCATCCTCAAGAAGGTGTT-3′，下游引物為5′-GGTAGGTGTCGAAGCCC-3′；GAPDH上游引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下游引物為5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算PCNA mRNA相對表達量。②CCK-8法：收集轉染后的肝癌細胞，以4×103/孔接種96孔板，并設置5個復孔；每孔完全培養基終體積為100 μL，置于細胞培養箱中培養6 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，置于培養箱中孵育4 h，使用酶標儀檢測波長450 nm處的OD值，判斷細胞增殖活性。③克隆形成實驗：收集轉染后的肝癌細胞，以1×103/孔接種6孔板，置于細胞培養箱中培養，每隔2 d換液1次。待細胞形成肉眼可見的克隆集落，棄去培養基，PBS緩慢沖洗3次。4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min；PBS清洗后干燥，肉眼觀察計數克隆形成數。上述實驗均重復3次，取均值。

1.4 SCARNA10在肝癌細胞中的核質分布觀察 采用核質分離提取實驗。將HepG2和MH97H細胞分別接種于直徑10 cm培養皿中，待細胞融合度達90%左右時收集細胞，使用PARIS試劑盒對核質組分分離提取。首先PBS緩慢沖洗細胞后，進行胰酶消化，將細胞轉移至1.5 mL EP管中；在4 ℃下以500 r/min離心5 min，棄上清。加入500 μL Fractination Buffer，輕輕吹打后于冰上靜置5 min。在4 ℃下以500 r/min離心5 min，將上清轉移至新的無RNase的1.5 mL EP管中，此即為胞質；沉淀即為胞核。分別對細胞質和細胞核進行RNA提取及逆轉錄，參照方法1.2。以研究明確細胞核中分布較高的lncRNA MALAT1為陽性對照，其上游引物為5′-GCTCTGTGGTGTGGGATTGA-3′、下游引物為5′-GTGGCAAAATGGCGGACTTT-3′。采用qPCR法檢測SCARNA10、MALAT1及β-actin(陰性對照)在細胞核和細胞質中的Ct值，計算相對表達比例。細胞核相對表達比例=2細胞核Ct-細胞質Ct/(1+2細胞核Ct-細胞質Ct)×100%，細胞質相對表達比例=1-細胞核相對表達比例。實驗重復3次，取均值。

1.5 SCARNA10與SUZ12、EZH2的相互作用觀察 采用RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗。用含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIP液分別裂解肝癌細胞，將細胞裂解產物與抗體偶聯磁珠或對照IgG于4 ℃孵育6 h；將磁珠洗凈并與蛋白酶K于冰上孵育5 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min；進一步將磁珠分別與5 mg SUZ12或EZH2抗體混合，室溫下360°旋轉孵育30 min；取上清液，加入RIP緩沖液，4 ℃過夜。將產物進行熒光定量PCR檢測，以IgG作為陰性對照，分析SCARNA10與SUZ12及EZH2的相對結合量。

2 結果

2.1 肝癌細胞與正常肝細胞中SCARNA10表達比較 HepG2、MH97H中SCARNA10相對表達量分別為2.94±1.00、4.61±1.23，均高于L-7702細胞中的1.11±0.21(P均<0.05)。

2.2 SCARNA10對肝癌細胞增殖的影響 與轉染NC比較，轉染siRNA的HepG2、MH97H細胞中PCNA mRNA表達量、細胞增殖OD值均降低，細胞克隆數均減少(P均<0.05)。見表1。

2.3 SCARNA10在肝癌細胞中的核質分布情況 核質分離提取實驗顯示，SCARNA10在HepG2、MH97H細胞胞核內的表達比例高于胞質內表達比例(P均<0.05)。見表2。

表1 HepG2、MH97H細胞轉染后PCNA mRNA表達、細胞增殖及細胞克隆數比較

表2 HepG2、MH97H細胞胞核和胞質中β-actin、MALAT1、SCARNA10的相對表達比例

2.4 SCARNA10與SUZ12、EZH2的相互作用結果 HepG2細胞中SCARNA10與SUZ12、EZH2的相對富集量分別為5.05±1.39、3.95±0.67，MH97H細胞中分別為6.71±2.60、4.47±1.75。

3 討論

人類基因組中只有約2%的基因參與編碼蛋白質，其余多數基因雖不參與編碼蛋白質，但可參與基因組印記、染色質修飾、X染色體沉默、轉錄激活及干擾等[12,13]。lncRNA可通過調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移及血管形成等過程，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用[14]。目前我國肝癌確診主要通過肝穿刺進行活檢，該項目為有創檢查，且假陰性率較高。盡管腫瘤標志物AFP已作為肝癌的篩查指標，但其敏感度較低，大部分患者確診時已進展為肝癌晚期，預后較差[15]。因此，臨床上亟需找到特異度和敏感度均較高的標志物，以提高肝癌早期診斷率，從而改善患者預后[3]。

已有研究表明，lncRNA可通過不同機制參與肝癌的發生發展，但lncRNA SCARNA10在肝癌中的研究尚未有報道[16,17]。本研究利用兩種人肝癌細胞HepG2和MH97H為體外研究模型，探討SCARNA10在肝癌中的生物學功能。研究結果顯示，SCARNA10在肝癌細胞中的表達高于人正常肝細胞；敲低SCARNA10表達后，發現HepG2與MH97H細胞中PCNA mRNA表達量相對減少，提示干擾SCARNA10后促增殖相關標志基因表達減低。進一步行CCK-8實驗及克隆形成實驗，發現HepG2與MH97H細胞敲低SCARNA10表達后細胞增殖OD值及克隆數均降低，提示干擾SCARNA10后肝癌細胞增殖能力降低。以上結果表明，SCARNA10在肝癌細胞中高表達且可促進肝癌細胞的增殖，其可作為促癌因子參與肝癌的發生。

為進一步探究SCARNA10促進肝癌發生的機制，通過核質分離提取實驗發現SCARNA10主要定位于肝癌細胞核中，表明其可能通過與染色質修飾酶結合從而表觀激活或沉默靶基因以發揮促癌作用。已有研究報道，約20%的lncRNA可與多梳抑制復合物PRC2的組分結合。PRC2主要參與基因沉默，其核心組分包含EED、SUZ12、EZH1和EZH2，其中EZH1和EZH2具有組蛋白H3第27位賴氨酸(H3K27)甲基轉移酶的功能[18,19]。EZH1和EZH2作為催化亞基，與另兩個組分EED和SUZ12一起變構活化PRC2，從而介導H3K27三甲基化(H3K27me3)的形成；H3K27me3是一類非常重要的組蛋白修飾，通過抑制基因表達，在胚胎發育和疾病發生方面發揮重要作用[20]。然而，PRC2如何募集靶基因序列尚不明確。本研究RIP結果顯示，SCARNA10可以與PRC2組分SUZ12和EZH2結合。因此，我們認為SCARNA10可能通過與SUZ12和EZH2結合，從而釋放PRC2對下游基因的募集，以調控靶基因的表達，進一步促進肝癌細胞的增殖。但具體下游調控的基因及機制尚不明確，需未來進一步深入研究。

綜上所述，SCARNA10可能在細胞核中通過與SUZ12、EZH2結合促進肝癌細胞增殖，從而參與肝癌的發生發展。本研究初步探明了SCARNA10在肝癌中的功能及機制，為肝癌的診療提供了新靶標。