lncRNA FLVCR1-AS1靶向miR-381-3p對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其分子機制

許國彩，劉芝蘭，逯艷艷

青海省人民醫院，西寧810002

結直腸癌(CRC)是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一，其發生發展的分子機制較為復雜，癌基因或抑癌基因異常表達與CRC發生及發展密切相關[1，2]。因此，進一步探究CRC發生發展的分子機制有助于提高療效及改善患者預后。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在CRC等惡性腫瘤中異常表達，并可發揮癌基因或抑癌基因作用[3]。有研究發現，lncRNA FLVCR1-AS1在肺癌細胞中高表達，沉默表達后可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲[4]；另外，FLVCR1-AS1還可作為miR-155的競爭性內源RNA促進胃癌的發生[5]。但是，FLVCR1-AS1在CRC發生發展過程中的作用機制尚未見報道。Starbase預測FLVCR1-AS1與微小RNA-381-3p(miR-381-3p) 存在結合位點，而miR-381-3p可通過靶向LRP6表達抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲[6]，或通過靶向FGFR2的表達從而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖[7]。但是，CRC中是否存在FLVCR1-AS1靶向調控miR-381-3p表達尚未可知。2017年2月～2019年10月，我們通過檢測FLVCR1-AS1、miR-381-3p在CRC細胞中的表達水平，探討其對CRC細胞增殖及凋亡的影響及其可能的調控作用機制，旨在為CRC的靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 正常結腸上皮細胞FHC購自美國ATCC細胞庫；CRC細胞SW480、DLD-1、HCT116購自中國科學院細胞庫。RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；FLVCR1-AS1小干擾RNA(si-FLVCR1-AS1)及亂序無意義序列(si-con)、miR-381-3p模擬物(mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-con)、miR-381-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-381-3p)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine2000購自上海陽光生物科技有限公司；TRIzol、反轉錄試劑盒與SYBR熒光染料試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；MTT購自武漢艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液、TBST溶液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、ECL均購自美國Sigma公司；兔抗人細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 取凍存的FHC、SW480、DLD-1、HCT116，置于37 ℃恒溫水浴鍋內融解，于含10% FBS的RPMI 1640培養基中培養；以1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養；每3 d更換1次培養液，細胞傳代培養。

1.2.2 細胞中FLVCR1-AS1、miR-381-3p表達檢測 采用qRT-PCR法。取對數生長期的細胞，根據TRIzol試劑盒提取細胞總RNA；利用紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度，參照反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄合成cDNA。FLVCR1-AS1正向引物為5′-GTGGCTCTCTCGTTCCC-3′，反向引物為5′-CCGTCCTTCGGTAGTGTC-3′；miR-381-3p正向引物為5′-CTAGTGATATACTTTATGTCACTT-3′，反向引物為5′-CATCATAGAAATAGAGTGTTTAAG-3′，均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。再以cDNA為模板，參照SYBR熒光染料試劑盒說明書配置反應體系，置于PCR儀進行擴增。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環40次。FLVCR1-AS1以β-actin為內參，miR-381-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt計算FLVCR1-AS1、miR-381-3p相對表達量。

1.2.3 細胞分組與轉染處理 取FLVCR1-AS1表達最高的對數生長期CRC細胞，以胰蛋白酶消化；調整細胞密度至5×103/mL；以200 μL/孔接種于6孔板，隨機分為7組：NC組不處理，si-con組轉染si-con，si-FLVCR1-AS1組轉染si-FLVCR1-AS1，miR-con組轉染miR-con，miR-381-3p組轉染miR-381-3p mimics，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-con組共轉染si-FLVCR1-AS1與anti-miR-con，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組共轉染si-FLVCR1-AS1與anti-miR-381-3p；轉染前1 h更換為不含FBS的培養基，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書操作，轉染6 h后更換為含10% FBS的RPMI 1640培養基繼續培養48 h。

1.2.4 細胞增殖情況觀察 采用MTT法。收集各組細胞，以100 μL/孔(3×105/mL)接種96孔板；分別于接種24、48、72 h時，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL室溫孵育4 h。棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL，37 ℃搖床內孵育10 min；置于酶標儀上檢測490 nm波長下各孔吸光度(A)，每組實驗均重復3次。細胞存活率(%)=(實驗孔A值-空白對照孔A值)/(正常對照孔A值-空白對照孔A值)×100%。

1.2.5 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。收集各組細胞，以預冷的PBS洗滌，用胰蛋白酶消化；以10 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入1 mL結合緩沖液；再以10 000 r/min離心5 min，加入100 μL結合緩沖液；分別加入5 μL Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育20 min；加入400 μL結合緩沖液，置于流式細胞儀檢測算細胞凋亡率。

1.2.6 細胞中Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min；常規離心后提取細胞總蛋白，BCA定量蛋白；制備濃縮膠與分離膠，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白；轉膜、封閉后分別加入各蛋白一抗稀釋液，其中Cyclin D1稀釋1∶500、Cleaved-Caspase-3稀釋1∶1 000，4 ℃孵育24 h；TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)孵育1 h；TBST洗滌，ECL顯影，以凝膠成像系統及Quantityone軟件檢測條帶灰度值；以β-actin為內參，用目的蛋白與內參灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.7 FLVCR1-AS1與miR-381-3p的調控關系分析 先用Starbase對FLVCR1-AS1和miR-381-3p結合進行預測，將含有結合位點的片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體構建野生型載體WT-FLVCR1-AS1；利用基因突變技術將結合位點進行突變，將含有突變位點的片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體構建突變型載體MUT-FLVCR1-AS1。在結腸癌細胞中轉染miR-381-3p mimics/miR-con和FLVCR1-AS1野生型/突變型報告基因載體，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 正常結腸上皮細胞與CRC細胞中FLVCR1-AS1、miR-381-3p表達比較 與FHC比較，SW480、DLD-1、HCT116中FLVCR1-AS1表達水平均升高而miR-381-3p表達水平均降低(P均<0.05)；其中SW480的FLVCR1-AS1表達最高，因而選用SW480細胞進行后續研究。見表1。

表1 正常結腸上皮細胞與CRC細胞中FLVCR1-AS1、miR-381-3p表達比較

2.2 各組SW480細胞增殖、凋亡情況及細胞中Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量比較 與NC組、si-con組、miR-con組比較，si-FLVCR1-AS1組、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-con組細胞存活率降低、細胞凋亡率升高，細胞中Cyclin D1蛋白表達量降低、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量升高(P均<0.05)；miR-381-3p組細胞存活率降低、細胞凋亡率升高，細胞中Cyclin D1蛋白表達量降低、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量升高(P均<0.05)；NC組、si-con組、miR-con組兩兩比較，差異均無統計學意義；與si-FLVCR1-AS1+anti-miR-con組比較，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組細胞存活率升高、細胞凋亡率降低，細胞中Cyclin D1蛋白表達量升高、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組SW480細胞增殖、凋亡情況及細胞中Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量比較

2.3 FLVCR1-AS1與miR-381-3p的調控關系 Starbase預測顯示，FLVCR1-AS1與miR-381-3p存在靶向結合位點，見圖1。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，在轉染野生型載體WT-FLVCR1-AS1的SW480細胞中，共轉染miR-381-3p mimics的熒光素酶活性低于共轉染miR-con的細胞(P<0.05)；在轉染突變型載體MUT-FLVCR1-AS1的SW480細胞中，共轉染miR-con或miR-381-3p mimics的熒光素酶活性無明顯變化。見表3。

圖1 FLVCR1-AS1和miR-381-3p結合的Starbase預測示意圖

表3 miR-381-3p mimics/miR-con和WT/MUT-FLVCR1-AS1報告基因載體共轉染SW480細胞后熒光素酶活性比較

3 討論

lncRNA不具有編碼蛋白質的功能，但可通過與miRNA或蛋白質相互作用從而調控細胞增殖、分化等過程。研究表明，lncRNA可通過調控腫瘤細胞生長、凋亡及轉移等生物學行為從而影響CRC發生發展進程[8～10]。目前CRC發病率及病死率仍逐年上升，CRC的基因治療雖取得一定效果，但患者生存期仍較短。因此，本研究積極探尋新型lncRNA分子，通過分析其在CRC發生及發展中的分子機制，為CRC基因治療提供潛在靶點。

研究發現，FLVCR1-AS1可通過調控miR-513/YAP1分子軸促進卵巢癌細胞遷移、侵襲及EMT轉化過程[11]；另外，FLVCR1-AS1還可充當miR-485-5p的海綿分子從而促進膽管癌細胞增殖、遷移及侵襲[12]，或充當miR-573的海綿分子而促進肺癌細胞增殖及侵襲[13]。但是，FLVCR1-AS1在CRC中的表達水平尚未可知。本研究結果顯示，FLVCR1-AS1在CRC不同細胞中的表達水平均高于正常結腸上皮細胞，提示FLVCR1-AS1表達升高可能促進CRC的發生。本研究通過體外細胞實驗發現，抑制FLVCR1-AS1的表達可降低CRC細胞活力，提高細胞凋亡率，提示抑制FLVCR1-AS1表達可抑制CRC細胞增殖、促進細胞凋亡。眾所周知，細胞增殖與細胞凋亡失衡是導致腫瘤發生發展的重要原因之一。研究表明，Cyclin D1與CDK6結合形成復合物可促進細胞周期由G1期進展為S期，從而加速細胞增殖[14]；細胞收到凋亡信號時，Caspase-3被激活形成Cleaved-Caspase-3從而促進細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，抑制FLVCR1-AS1表達后，CRC細胞中Cyclin D1表達水平降低而Cleaved-Caspase-3表達水平升高。這提示抑制FLVCR1-AS1表達可能通過上調Cleaved-Caspase-3表達及下調Cyclin D1表達，從而抑制CRC細胞增殖并誘導細胞凋亡。

研究表明，lncRNA可通過充當miRNA競爭性結合內源性RNA而發揮作用。本研究通過Starbase預測顯示，FLVCR1-AS1與miR-381-3p存在靶向結合位點；雙熒光素酶報告實驗證實，FLVCR1-AS1能夠特異性結合miR-381-3p。研究發現，miR-381-3p在宮頸癌細胞中呈低表達，并可通過下調FGF7表達而抑制宮頸癌的進展[16]；膀胱癌細胞miR-381-3p表達量降低，還可促進膀胱癌細胞周期轉換[17]。相關報道顯示，敲減SETDB1后可通過上調miR-381-3p表達以抑制乳腺癌進程[18]。本研究結果顯示，miR-381-3p在CRC細胞中的表達水平降低；進一步研究發現，miR-381-3p過表達后，CRC細胞活力降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1蛋白表達量降低，Cleaved-Caspase-3蛋白表達量升高，提示miR-381-3p過表達可抑制CRC細胞增殖并促進細胞凋亡。為探究FLVCR1-AS1是否通過調控miR-381-3p影響CRC發生及發展進程，我們對SW480共轉染si-FLVCR1-AS1與anti-miR-381-3p；結果顯示，抑制miR-381-3p表達可逆轉抑制FLVCR1-AS1表達對CRC細胞增殖及凋亡的影響。這提示抑制FLVCR1-AS1的表達可通過上調miR-381-3p的表達，從而抑制CRC細胞增殖并誘導細胞凋亡。

綜上所述，在CRC中FLVCR1-AS1呈高表達，miR-381-3p表達下調；FLVCR1-AS1可能通過充當miR-381-3p競爭性內源性RNA而抑制其表達，從而促進CRC細胞增殖并抑制細胞凋亡，該作用可通過上調Cleaved-Caspase-3表達及下調Cyclin D1表達實現。因此，FLVCR1-AS1可能作為CRC診斷及治療的潛在靶點。但關于體內實驗與臨床研究中FLVCR1-AS1與miR-381-3p的表達及其調控作用仍需進一步證實，同時關于miR-381-3p下游可能調控的靶基因還需深入研究。