轉染靶向Bcl-xL脫氧核酶后直腸癌細胞SW837的輻射和化療敏感性變化

于震，曾祥岳，孟濤，葛磊，楊新輝

新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院(附屬腫瘤醫(yī)院)，烏魯木齊830010

結直腸癌(CRC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，治療方法主要為手術切除及放化療[1]；當手術切除腫瘤組織后，一些患者需行化療或放療等輔助療法清除殘存腫瘤細胞[2]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種臨床常用化療藥物，放療中多使用電離輻射如X射線，二者均通過誘導細胞凋亡的方式達到抗腫瘤治療作用[3，4]。Bcl-xL屬于抗凋亡蛋白，可通過調控線粒體膜通透性及抑制細胞色素C釋放來阻止細胞凋亡[5]。已有研究表明，Bcl-xL在CRC組織中高表達，且與患者不良預后呈正相關[6,7]。這些結果提示，直腸癌細胞中Bcl-xL高表達可能會增加治療的抗性程度。因此，從凋亡角度開發(fā)靶向Bcl-xL的藥物，將有助于提高放化療的療效。脫氧核酶是一種兼具較高催化活性及較好穩(wěn)定性的新型核酶，能特異地切割單鏈RNA(ssRNA)中嘌呤-嘧啶連接的寡核苷酸，具有催化降解RNA的作用[8]。RNA切割作用是目前研究的熱點，可用來靶向敲低目的基因的表達[9，10]。Yu等[11]針對Bcl-xL設計出了一系列脫氧核酶，其中DT888、DT884、DT883和DT882可有效抑制Bcl-xL在人前列腺癌PC3細胞中蛋白水平的表達，DT882可誘導PC3細胞凋亡并降低其細胞活力。2018年9月～2019年1月，我們觀察了靶向Bcl-xL脫氧核酶對直腸癌細胞SW837輻射和化療敏感性的影響，為靶向Bcl-xL脫氧核酶的臨床研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：直腸癌細胞系SW837購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：胎牛血清、L-15培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MTT試劑、蛋白裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司；Bcl-xL抗體購自美國CST公司；5-FU購自美國MCE公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自中國貝博生物；DT882以及隨機對照序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(DT882序列：5′-TTTTTATAAGGCTAGCTACAACGAAGGGATGGG-3′)；轉染試劑Lipofectamine3000以及TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與輻射、化療劑量的確定 將SW837細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，待細胞處于對數(shù)生長期時消化細胞，按照1×104/孔接種到96孔板中培養(yǎng)過夜。取SW837細胞，分別以終濃度5、10、20 mg/L的5-FU處理，或采用美國RadSource直線加速器(設置參數(shù)為160 kV、25 mA，劑量率為1.15 Gy/min)以2、4、6、8 Gy的X射線進行照射處理。處理48 h后加入20 μL MTT溶液，孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩搖勻；用酶標儀檢測波長492 nm時的吸光度，計算細胞增殖抑制率。結果顯示，X射線以及5-FU均呈劑量依賴性抑制SW837的細胞活力，X射線劑量為8 Gy時抑制率最高(88.46%±1.70%)，5-FU濃度為20 mg/L時抑制率最高(65.03%±1.15%)。在后續(xù)實驗中，采用8 Gy X射線以及20 mg/L 5-FU進行處理。

1.2.2 細胞分組與轉染處理 將SW837細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，待細胞處于對數(shù)生長期時消化細胞，按照3×105/孔接種到6孔板中培養(yǎng)過夜。將細胞隨機分為6組：轉染對照組、轉染輻射組、轉染化療組均先用Lipofectamine3000轉染試劑轉染脫氧核酶DT882，對照組、對照輻射組、對照化療組均不轉染處理；轉染48 h后，轉染輻射組、對照輻射組均以8 Gy X射線處理48 h，轉染化療組、對照化療組均以20 mg/L 5-FU處理48 h，轉染對照組和對照組不處理。

1.2.3 細胞中Bcl-xL mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。收集各組細胞，采用TRIzol提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA；以cDNA為模板，采用熒光定量PCR試劑檢測Bcl-xL mRNA表達。引物序列：Bcl-xL上游為5′-ACTTACCTGAATGACCACCTAGAGCC-3′，下游為5′-GAAGAGTGAGCCCAGCAGAACC-3′；β-actin上游為5′-CAACCGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，下游為5′-ACGGCCAGAGGCGTACAGGGAT-3′。采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，以β-actin作為內參，計算Bcl-xL基因相對表達量。

1.2.4 細胞中Bcl-xL蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，以RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳；采用PVDF膜進行蛋白轉移，分別用Bcl-xL、β-actin一抗以及對應的二抗進行孵育；ECL發(fā)光液曝光，采用凝膠成像儀拍照并進行分析，以目的蛋白與內參吸光度比值作為Bcl-xL蛋白相對表達量。

1.2.5 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。收集各組細胞，以胰酶消化細胞；先用Annexin V-FITC試劑染色15 min，再以PI復染15 min；采用BD公司流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 各組細胞中Bcl-xL表達比較 細胞中Bcl-xL mRNA及蛋白表達量對照組>對照輻射組、對照化療組>轉染對照組>轉染輻射組、轉染化療組，P均<0.05或<0.01；對照輻射組與對照化療組、轉染輻射組與轉染化療組比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組細胞中Bcl-xL表達比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 細胞凋亡率對照組(3.41%±1.22%)<對照輻射組(26.16%±3.60%)、對照化療組(29.17%±4.29%)<轉染對照組(28.72%±3.07%)<轉染輻射組(55.58%±6.16%)、轉染化療組(58.15%±7.39%)，P均<0.01；對照輻射組與對照化療組、轉染輻射組與轉染化療組比較，P均>0.05。

3 討論

細胞凋亡通路的抑制在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，誘導細胞凋亡也是目前腫瘤治療的重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)，臨床常用的治療手段如放療使用的X射線以及化療藥物5-FU均可誘導直腸癌細胞SW837凋亡，并降低Bcl-xL的表達；通過使用脫氧核酶DT228靶向敲低SW837細胞中Bcl-xL表達后，則極大地增加X射線以及5-FU治療的放化療敏感性。以上結果表明，靶向Bcl-xL脫氧核酶DT228可通過降低Bcl-xL表達的方式，提高直腸癌細胞SW837輻射敏感性和化療藥物敏感性。

Bcl-xL屬于Bcl-2家族成員，在細胞凋亡信號轉導中具有重要作用。Bcl-2家族蛋白可通過與具有BH3結構域的促凋亡蛋白Bax或Bak蛋白結合，形成的異源二聚體可抑制細胞凋亡發(fā)生[12]。Bcl-2家族蛋白成員包括Bcl-2、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1和Bcl-xL，只有Bcl-xL在人結腸癌組織中高表達[7,13]。特異性敲除小腸上皮細胞Bcl-xL表達可顯著降低炎癥刺激所誘導的腫瘤發(fā)生，且Bcl-xL抑制劑ABT-737可誘導結腸癌細胞凋亡[7]。這些研究結果均表明，Bcl-xL高表達介導的凋亡逃逸在結腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，靶向Bcl-xL是結腸癌潛在的治療靶點。

脫氧核酶是一類兼具有較高催化活性及穩(wěn)定性的新型核酶[8]，完全由DNA構成。在體內環(huán)境中，其結構上的穩(wěn)定性遠高于內源性RNA構成的核酶，并能夠使得RNA發(fā)生水解，從而在轉錄水平上發(fā)揮基因調控作用[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，靶向Bcl-xL脫氧核酶可誘導前列腺癌PC3細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向Bcl-xL脫氧核酶DT882不僅可抑制直腸癌SW837細胞Bcl-xL的表達，同時可誘導細胞凋亡，提示靶向Bcl-xL脫氧核酶具有抗直腸癌細胞作用。

目前，以5-FU為基礎的化療和X射線為基礎的放療被廣泛用于臨床CRC的治療。5-FU以及X射線主要通過線粒體依賴的凋亡方式誘導腫瘤細胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細胞中抗凋亡蛋白(如Bcl-xL)表達異常升高，這可能是導致其放化療抵抗性的重要機制[14]。已有研究表明，Bcl-xL高表達可抑制5-FU對CRC細胞凋亡的誘導作用[15]。這些結果提示，靶向抑制Bcl-xL表達可能有效提高5-FU的化療效果。反義脫氧核酸和miR-122均可通過靶向Bcl-xL下調其表達的方式誘導CRC細胞凋亡，并增加CRC細胞對5-FU的藥物敏感性[16，17]。研究發(fā)現(xiàn)，靶向Bcl-xL脫氧核酶DT882可增加前列腺癌細胞PC3對紫杉醇的藥物敏感性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單一處理相比，DT882與5-FU復合處理顯著誘導直腸癌細胞SW837凋亡，同時抑制Bcl-xL的表達，提示靶向Bcl-xL脫氧核酶DT882可增加直腸癌細胞SW837對5-FU的化療敏感性。

與對5-FU的抗性機制類似，腫瘤細胞輻射敏感性的降低亦與Bcl-xL高表達相關。因此，靶向抑制Bcl-xL也能夠增加腫瘤細胞的輻射敏感性。通過siRNA方法降低Bcl-xL表達不僅可以抑制CRC細胞增殖、遷移與侵襲，也通過促進凋亡的方式增加細胞的輻射敏感性[18]。與單獨X射線處理相比，Bcl-xL抑制劑ABT-737可有效抑制肺癌移植瘤的生長[19]。在細胞水平上，Bcl-xL抑制劑ABT-737也可增加HeLa細胞的輻射敏感性[20]。此外，下調Bcl-xL表達也可顯著增加骨肉瘤細胞以及前列腺癌細胞的輻射敏感性[21，22]。除Bcl-xL抑制劑外，靶向Bcl-xL也可達到與ABT-737相同的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，X射線可抑制直腸癌細胞Bcl-xL表達，提示Bcl-xL表達下調可能參與了X射線對細胞凋亡的誘導作用；當靶向Bcl-xL脫氧核酶與X射線復合處理時，DT882顯著增加X射線誘導的細胞凋亡。這些結果表明，脫氧核酶與X射線的聯(lián)合使用可能是CRC有效的治療手段。

值得注意的是，雖然靶向Bcl-xL脫氧核酶可與Bcl-xL抑制劑達到相同的促進凋亡效果，但其具體機制不同。廣泛研究的Bcl-xL抑制劑ABT-737屬于BH3類似藥物，其作為拮抗劑可與Bcl-2家族蛋白高親和力結合，從而破壞Bcl-2家族蛋白與促凋亡蛋白Bax、Bak結合，達到促進凋亡的作用[23]。而脫氧核酶可以選擇性地與靶基因結合，從轉錄水平上直接抑制靶基因表達。此外，相比于其他類型的藥物，脫氧核酶更加便宜且具有較高的穩(wěn)定性[8,24]，這些優(yōu)點使脫氧核酶成為具有廣泛應用前景的分子靶向治療藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向Bcl-xL脫氧核酶DT882可增加直腸癌細胞SW837對X射線的輻射敏感性以及對5-FU的藥物敏感性，其機制可能與DT882抑制Bcl-xL表達進而促進細胞凋亡相關。因此，靶向Bcl-xL脫氧核酶DT882可能具有一定的臨床應用前景。