超高效液相色譜-飛行時間-串聯質譜法對3 種藍靛果忍冬果實中花青苷的比較分析

張上上，鄭姝寧，王學濤，倪 陽，王 英

（1.秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066000；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部蔬菜產品質量安全風險評估實驗室（北京），北京 100081）

藍靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.），又名藍靛果，屬于忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木，是一種新興的野生漿果資源。藍靛果忍冬喜冷涼濕潤性氣候，抗寒能力強[1]，主要分布在我國吉林省長白山、黑龍江省大興安嶺山區[2]。果實為紫黑色或藍黑色漿果，橢圓形或長圓形，皮薄籽小，質地細膩，口感酸甜風味獨特，可鮮食，出汁率高，適合加工成酒類、飲料、果醬等衍生食品[3-4]。研究發現，藍靛果忍冬果實含有豐富的營養物質如糖類、有機酸、氨基酸、礦物質、維生素和微量元素等，還含有花青苷、黃酮、三萜、原花青素、兒茶素等活性物質[5-8]。在傳統醫學中，藍靛果忍冬果實可入藥, 性苦涼，具有清熱瀉火、散癰消腫等功效，可用于治療濕熱痢疾、大便赤白等疾病。現代醫學研究表明，藍靛果忍冬具有促進血液循環、防治心血管病、降血壓、清熱解毒、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗輻射、改善肝臟的解毒功能等功效[9-11]。可見，藍靛果忍冬是一種具有較高營養價值和藥用價值的小漿果，具有廣闊的開發利用前景。

花青苷是常見的植物水溶性色素，是一類具有苯并吡喃結構的類黃酮化合物，是植物體內重要的次級代謝產物。藍靛果含有豐富的花青苷，不僅可以作為天然色素的良好來源，也是藍靛果忍冬生物學活性的重要物質基礎，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖、抗炎、抗腫瘤、調節免疫、改善血液循環和預防心血管疾病等多種活性[12-16]。花青苷的化學結構決定其生物學功能，不同的花青苷苷元、糖基基團、酰基基團及其不同的結合方式，形成不同種類的花青苷進而具有不同的生物學活性。因此，研究藍靛果忍冬花青苷的組成和相對含量，對綜合開發藍靛果忍冬相關產品具有重要意義。

已有研究表明[17]，不同品種的藍靛果忍冬果實性狀差異較大，綜合平均單株產量、百果質量、最大單果質量、果實橫徑、果實縱徑、果實風味等方面，發現藍靛果忍冬格爾達、伊利亞特和別列里的表現較好。因此本研究以這3 種藍靛果忍冬為研究材料，利用超高效液相色譜-飛行時間-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-TOF-MS/MS）技術，比較研究3 種不同品種藍靛果忍冬果實中花青苷的種類、分子結構和相對含量，以期為進一步研究花青苷在藍靛果忍冬中合成與積累的分子遺傳機制以及選育富含花青苷的藍靛果忍冬優良品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果忍冬果實購于黑龍江省黑河市中俄林業科技合作園。挑選出生長良好、無病蟲害和機械損傷、成熟期的藍靛果忍冬果實，其中伊利亞特果皮為藍紫色，果肉為深紅色，果實形狀為橢圓形，最大單果質量為1.37 g；別列里果皮為藍紫色，果肉為深紅色，果實形狀為長圓形，最大單果質量為1.44 g；格爾達果皮為藍紫色，果肉為淺紅色，果實形狀為橢圓形，最大單果質量為1.05 g。液氮速凍后轉移至－80 ℃冷凍貯藏備用。

乙腈（色譜級） 美國JT Baker公司；甲酸、鹽酸（均為色譜級） 美國Fluka公司；花青苷標準物質：飛燕草色素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-木糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷（純度均大于97%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

LC-30A UPLC儀 日本島津公司；6600 TOF-MS/MS儀 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

花青苷的提取參考文獻[18]的方法并加以改進。將冷凍的藍靛果忍冬果實常溫解凍后勻漿，準確稱取2.00 g勻漿液于50 mL離心管中，加入10 mL酸化甲醇提取液（0.1% HCl，V/V），振蕩混勻后室溫下超聲提取30 min。其中酸化甲醇提取液能夠防止花青苷的降解[19]。4 ℃、13 000 r/min離心15 min，上清液于35 ℃旋轉蒸干。取2.0 mL酸化超純水（0.1%甲酸，V/V）進行復溶，經0.22 μm濾膜過濾，濾液進樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：溶劑A為水溶液（0.1%甲酸，V/V）；溶劑B為乙腈溶液（0.1%甲酸，V/V）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for liquid chromatography

1.3.3 質譜條件

AB SCIEX 6600 TOF-MS/MS系統，配Turbo VTM源離子；正離子掃描方式，噴霧電壓＋5 500 V；飛行時間質譜全掃描-信息關聯采集-子離子掃描（TOF-MS scan-IDA-product ion scan）模式；全掃描m/z100～1 000，分辨率30 000 FWHM；霧化氣壓力0.34 MPa，氣簾氣壓力0.24 MPa，輔助霧化氣壓力0.34 MPa，以上3 種氣體均為氮氣；離子源溫度為550 ℃；去簇電壓80 V；IDA觸發10 個子離子掃描，即每個循環選擇10 個最強的離子進行MS/MS分析；子離子掃描的m/z50～1 000，碰撞電壓35 eV，碰撞電壓差15 eV，離子駐留時間100 ms。

1.4 數據分析

利用Analyst TF軟件進行數據采集，PeakView和MasterView軟件進行花青苷化合物的結構鑒定分析。基于一級質譜TOF-MS的精確質量數、同位素分布以及化合分子不飽和度等信息，利用PeakView軟件中的FormularFinder功能，推測花青苷化合物可能的分子式；進一步基于二級質譜TOF-MS/MS產生的高分辨率、高準確質量數的碎片離子信息，結合花青苷質譜裂解規律，推測花青素苷元、糖基以及取代基的種類；綜合考慮花青苷化合物極性及色譜洗脫順序，參考相關文獻和數據庫（mass bank，dictionary of natural products，KEGG，HMDB），完成花青苷組分的結構鑒定；最后利用已有的標準物質對花青苷的定性結果進行驗證。對于已鑒定的花青苷化合物，計算一級質譜中的提取離子色譜峰的峰面積，對藍靛果忍冬中花青苷類化合物的相對含量進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 藍靛果忍冬果實中花青苷的結構鑒定分析

利用已建立的UPLC-TOF-MS/MS方法，對藍靛果忍冬果實中的花青苷提取物進行進樣分析。采用反相色譜法對花青苷進行色譜分離，UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為固定相，乙腈-水系統為流動相，添加0.1%甲酸（V/V）作為酸性添加劑，維持花青苷陽離子的穩定性，同時可以提高花青苷的色譜分離度，減少色譜峰拖尾現象[20-21]。

圖1 3 種藍靛果忍冬伊利亞特（a）、別列里（b）和格爾達（c）果實中花青苷提取物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of anthocyanin extracts from three varieties of blue honeysuckle: Iliad (a), Berel (b) and Gerda (c)

由圖1可以看出，利用TOF-MS的高分辨率特點，結合TOF-MS scan-IDA-product ion scan復合掃描模式，一次進樣分析即可同時獲得花青苷的一級質譜分子離子和二級質譜碎片離子的精確質量數，結合同位素分布比、質譜裂解規律、化合物極性及色譜洗脫順序，并通過與文獻[22-27]進行比對，在藍靛果忍冬果實中共鑒定24 種花青苷類化合物，具體的結構鑒定結果見表2。其中矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-木糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖苷10 種花青苷利用對照品完成了對定性結果的確證。此外，矢車菊素-3-木糖苷、矢車菊素-3-鼠李糖苷、矢車菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢車菊素-3,5-雙半乳糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷、矢車菊素-3-雙己糖苷、矢車菊素-3-丙二酰己糖苷、芍藥素-3-雙己糖苷和飛燕草素-3-雙己糖苷9 種花青苷為首次在藍靛果忍冬果實中被發現。

表2 藍靛果忍冬果實中花青苷的定性分析結果和提取離子色譜峰面積Table 2 Identification of anthocyanins and peak areas of the extracted ion chromatograms of anthocyanins in the fruits of blue honeysuckle

由表2可知，藍靛果忍冬果實中花青苷含有矢車菊素、芍藥素、飛燕草素和天竺葵素4 種苷元類型，表明藍靛果忍冬花青苷的苷元類型豐富；此外，花青苷的存在形式包含單糖苷、雙糖苷、酰基取代的花青苷和矢車菊素-3-己糖苷二聚體。其中單糖苷包含花青苷苷元3位取代的葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、木糖苷和鼠李糖苷4 種形式；而雙糖苷包含花青苷苷元3位取代的蕓香糖苷、槐糖苷、半乳糖酸木糖苷、桑布雙糖苷和雙己糖苷，以及3,5位取代的雙葡萄糖苷和雙半乳糖苷7 種形式；酰基取代的花青苷主要為乙酰基和丙二酰基取代的花青素-3-己糖苷。本實驗分別以單糖苷中的飛燕草素-3-葡萄糖苷、雙糖苷中的矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷、酰基取代花青苷中的芍藥素-3-乙酰基己糖苷為例，詳細解析藍靛果忍冬果實中這3 類花青苷的質譜行為和裂解規律，描述其質譜鑒定過程。

2.1.1 藍靛果忍冬果實中花青素單糖苷的結構鑒定分析

花青苷在正離子模式下以陽離子形成存在，主要的分子離子峰為[M]＋，花青素單糖苷的二級質譜裂解模式主要為糖苷鍵的斷裂，丟失單糖基團后生成花青苷苷元碎片離子[28]。飛燕草素-3-葡萄糖苷在正離子模式下的一級質譜圖見圖2a，分子離子峰為m/z465.102 4；其二級質譜圖見圖2b，通過3位糖苷鍵的斷裂，失去一分子已糖脫水基團（－162.052 6 Da），產生主要的碎片離子m/z303.049 8，為飛燕草素苷元離子，推斷該花青苷為飛燕草素-3-已糖苷；最后利用飛燕草素-3-葡萄糖苷標準品的進樣分析，對比保留時間、同位素分布比、一級和二級質譜圖，最終確定該花青苷為飛燕草素-3-葡萄糖苷。

圖2 正離子模式下藍靛果忍冬果實中飛燕草素-3-葡萄糖苷的一級（a）和二級（b）質譜圖Fig.2 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of delphinidin 3-glucoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

依照圖2花青素單糖苷的二級質譜斷裂規律，藍靛果忍冬果實花青苷提取物的TOF-MS/MS產物離子掃描中，得到的碎片離子含有m/z287.05、303.05、271.06、301.07，分別為矢車菊素苷元離子、飛燕草素苷元離子、天竺葵素苷元離子和芍藥素苷元離子；丟失的單糖基團分別為阿拉伯糖基或木糖基（－132.042 Da）、葡萄糖基（－162.052 Da）和鼠李糖基（－146.058 Da），結合相關花青苷標準品，最終在藍靛果忍冬果實中鑒定出7 種花青素單糖苷，分別為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-木糖苷、矢車菊素-3-鼠李糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷。

2.1.2 藍靛果忍冬果實中花青素雙糖苷的結構鑒定分析

藍靛果忍冬果實花青素雙糖苷的二級質譜裂解模式主要為苷元和雙糖之間的糖苷鍵斷裂，失去雙糖基團而產生相應的苷元碎片離子[29]。矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷在正離子模式下的一級質譜圖見圖3a，主要的分子離子峰為[M]＋（m/z611.161 4），其二級質譜圖見圖3b，通過3-位糖苷鍵的斷裂，失去一分子己糖脫水基團（－162.052 3 Da），產生相應碎片離子m/z449.109 1；進一步發生5-位糖苷鍵的斷裂，失去另一分子己糖脫水基團（－162.053 5 Da），生成矢車菊素苷元碎片離子m/z287.055 6，因此該花青苷被鑒定為矢車菊素-3,5-雙己糖苷；最后利用矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷標準品的進樣分析，對比保留時間、同位素分布比、一級和二級質譜圖，最終確定該花青苷為矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷。依照上述花青素雙糖苷的二級質譜斷裂規律，最終在藍靛果忍冬果實中完成了天竺葵素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷和飛燕草素-3-雙己糖苷等13 種花青素雙糖苷的結構鑒定。

圖3 正離子模式下藍靛果忍冬果實中矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷的一級（a）和二級（b）質譜圖Fig.3 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of cyanidin 3,5-diglucoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

2.1.3 藍靛果忍冬果實中酰基花青苷的結構鑒定分析

藍靛果忍冬果實中酰基花青苷的二級質譜裂解模式主要為苷元和酰基化糖基基團之間的糖苷鍵斷裂，失去酰基化糖基基團而生成苷元碎片離子[30-31]。芍藥素-3-乙酰基己糖苷在正離子模式下的一級質譜見圖4a，主要的分子離子峰為[M]＋（m/z505.133 5），其二級質譜見圖4b，通過3-位糖苷鍵的斷裂，失去一分子乙酰基己糖脫水基團（－204.062 Da），生成芍藥素苷元碎片離子m/z301.071 5，因此該花青苷被鑒定為芍藥素-3-乙酰基己糖苷。由于本研究尚無法獲得相關酰基花青苷的標準品，只能根據TOF-MS/MS中丟失的糖基基團的精確質量數推測為己糖苷，但無法明確具體的己糖類型。未來的研究中還需要通過標準物質、分析純化以及核磁等技術手段完成藍靛果忍冬果實中酰基花青苷準確的結構鑒定。依照上述質譜斷裂規律，最終在藍靛果忍冬果實中完成了矢車菊素-3-乙酰基己糖苷、矢車菊素-3-丙二酰己糖苷和芍藥素-3-乙酰基己糖苷等3 種酰基花青苷的結構鑒定。

圖4 正離子模式下藍靛果忍冬果實中芍藥素-3-乙酰基己糖苷的一級（a）和二級（b）質譜圖Fig.4 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of peonidin-3-acetylhexoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

2.2 3 種藍靛果忍冬果實中花青苷的比較分析

花青苷類化合物具有結構相似性，其質譜響應也具有相似性和可比性。通過一級質譜中花青苷的提取離子色譜峰峰面積比較分析不同品種藍靛果忍冬果實中花青苷類的相對含量，結果見表2。3 種藍靛果忍冬果實中花青苷類的組成存在明顯差異，其中伊利亞特果實中含有花青苷種類最豐富，共檢測到24 種花青苷；與伊利亞特相似，別列里果實中共檢測到23 種花青苷，其中矢車菊素-3-雙己糖苷未在別列里果實中被檢測到；而格爾達果實中含有的花青苷種類最少，只檢測到12 種花青苷。

3 種藍靛果忍冬果實中花青苷總含量的比較見圖5a，伊利亞特和別列里果實中花青苷的總含量顯著高于格爾達，這與伊利亞特和別列里深紅色果肉顏色，格爾達淺紅色果肉顏色的表型相符合。由表2可知，3 種藍靛果忍冬果實中主要的花青苷均為矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷，這4 種花青苷含量的總和分別占伊利亞特、別列里和格爾達花青苷總含量的94.9%、94.1%和99.1%，它們相對含量的比較分析見圖5b。矢車菊素-3-葡萄糖苷是藍靛果忍冬果實中相對含量最高的花青苷，分別占伊利亞特、別列里和格爾達花青苷總含量的72.4%、70.9%和89.7%；含量其次較高的是芍藥素-3-葡萄糖苷，分別占伊利亞特、別列里和格爾達花青苷總含量的10.1%、9.5%和7.1%；此外，矢車菊素-3,5-雙葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷的含量相對較少，則分別占伊利亞特花青苷總含量的7.4%和5.0%，占別列里花青苷總含量的6.7%和7.0%，占格爾達花青苷總含量的0.7%和1.6%。因此，藍靛果忍冬果實中主要的花青苷為矢車菊素類和芍藥素類花青苷，而天竺葵素類和飛燕草素類花青苷則含量較低。本研究得到的藍靛果忍冬果實花青苷的組成及其相對含量的分析結果均符合相關的文獻報道[32-33]，表明本實驗所建立的植物花青苷分析方法具有很好的準確性。此外，通過3 種不同品種藍靛果忍冬果實中花青苷的比較分析可知，與格爾達相比較，伊利亞特和別列里果實中含有種類豐富且含量較高的花青苷。

圖5 3 種藍靛果忍冬果實中總花青苷（a）和主要花青苷（b）相對含量的比較分析Fig.5 Comparative analysis of the relative contents of total (a) and major individual (b) anthocyanins in the fruits of three varieties of blue honeysuckle

3 結 論

本實驗以伊利亞特、別列里和格爾達為研究對象，利用UPLC-TOF-MS/MS技術，對這3 種藍靛果忍冬果實中的花青苷組分進行分析，詳細闡述了花青苷的質譜行為和二級質譜裂解規律，共鑒定出24 種花青苷，其中9 種花青苷為首次在藍靛果忍冬果實中被鑒定。3 種藍靛果忍冬果實中花青苷的組成和相對含量不同，在伊利亞特、別列里和格爾達果實中分別檢測到24、23、12 種花青苷，并且伊利亞特、別列里果實中含有的花青苷總量和每一種花青苷的相對含量均明顯高于格爾達，說明不同品種的藍靛果忍冬果實中花青苷存在多樣性和差異性。本實驗結果為進一步分析藍靛果忍冬花青苷類物質的遺傳機制，以及培育富含花青苷的藍靛果忍冬新品種提供重要的理論依據。