動物性食品中氟苯尼考檢測的電化學免疫傳感器構建

劉衛華，楊 茜，劉敏軒，于文龍，王向紅

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

氟苯尼考（florfenicol，FF）是第3代氯霉素類抗生素，于1988年誕生于美國，1999年在我國被批準為二類新獸藥。FF殺菌譜廣，可以有效殺滅厭氧革蘭氏陽性菌及陰性菌[1]，并且用藥后基本不再產生再生性貧血障礙[2-3]，目前已代替氯霉素（chloramphenicol，CAP），廣泛應用于水產養殖和畜牧業[4-9]。FF的過度使用，不但會導致用藥動物身體機能的下降，還會引起一系列人畜共患的細菌性疾病，FF的肝毒性和耐藥性等致病因素也極有可能轉移到人體中，埋下健康隱患[10-16]。對此，我國和歐盟都對動物肌肉中FF的殘留作出了限量規定，最大限量均為300 μg/kg，最小限量為100 μg/kg[17-18]。

近年來，多地市場的肉類、蛋類商品被查出FF殘留超標[19]，建立動物性食品中FF殘留的快速篩查方法也成為了研究熱點。

目前，最常用的FF檢測方法主要有高效液相色譜-串聯質譜法[20-22]、液相色譜-質譜聯用法[23-24]、氣相色譜法等儀器檢測方法[25-27]以及免疫分析法[28-30]。這些檢測方法雖然有很高的靈敏度，但因儀器不便攜、檢測成本高，無法實現樣品的現場檢測，因此需要研發FF殘留的快速檢測方法。電化學方法因具有儀器便攜、成本低、檢測周期短、操作簡便快速等優點，廣泛應用在農獸藥殘留、致病微生物等檢測領域中。高牧叢等[31]基于石墨烯（graphene，GR）-殼聚糖（chitosan，CS）復合材料制備了用于檢測尿酸的電化學免疫傳感器。在6～600 μmol/L線性范圍內呈現良好的線性關系，R2為0.993 4，檢出限為0.33 μmol/L（RSN=3），添加回收率在97.5%～101.3%之間。Qi Shaopeng等[32]制備了一種基于GR的萊克多巴胺（ractopamine，RAC）免疫傳感器，通過GR與RAC分子間的π-π吸附作用將RAC固定在GR表面，實現了RAC的特異性檢測。在0～4 000 ng/mL質量濃度范圍，RAC檢出限為0.06 ng/mL，實際豬肉樣品的加標回收率在93.6%～113.6%之間。Jijie等[33]建立了用于檢測致病性大腸桿菌的免疫傳感器。通過電沉積在金電極表面修飾了還原氧化石墨烯-聚乙烯亞胺復合薄膜，大腸桿菌的線性濃度范圍為1×101～1×104CFU/mL，相關系數為0.995，檢出限為10 CFU/mL，且特異性較好、靈敏度較高，可以用于實際血清、尿液和水樣品的檢測。

本實驗開發一種基于GR-CS復合修飾材料的電化學免疫傳感器，依據抗原和抗體的特異性結合，旨在建立檢測FF的電化學方法，應用于肉類和雞蛋樣品的現場檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、雞肉、雞蛋，購于河北省保定市。

FF、CAP、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海源葉生物科技有限公司；氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA）德國Witega公司；FF多克隆抗體（anti-FF）由本實驗室自制（效價1∶60 000，IC15為0.72 ng/mL，親和性較好）；CS 北京索萊寶科技有限公司；GR 北京德科島金科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CHI660E型電化學工作站、CHI 104 3 mm直徑玻碳盤電極（glass carbon disk electrode，GCE）、CHI 115鉑絲對電極、CHI 150飽和甘汞電極 上海辰華儀器有限公司；SKP-02.300電熱恒溫培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LCT Premier XE液相色譜-串聯質譜聯用儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 GR-CS復合材料的制備及表征

準確量取50.0 mL 0.05 mol/L HCl溶液，于恒溫水浴鍋中加熱至80～90 ℃，隨后加入準確稱取的50.0 mg CS粉末，攪拌溶解。溶解后取出冷卻至室溫，加入0.1 mol/L NaOH溶液調pH 5，配制成1 mg/mL的CS溶液，置于4 ℃備用。

準確稱取3.0 mg GR粉末，加入到1.0 mL配制好的1 mg/mL CS溶液中，超聲分散2 h，得到均勻分散的GR-CS混懸體系，質量濃度為3 mg/mL，置于4 ℃保存。

采用掃描電子顯微鏡觀察GR粉末和GR-CS復合修飾材料的形態。

1.3.2 GCE裸電極的修飾

GCE裸電極在使用前依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉在拋光絨布上拋光打磨，直至呈現光滑鏡面。隨后分別在硝酸溶液和乙醇溶液和去離子水中超聲，室溫下晾干。在pH 7.0含0.1 mol/L KCl和10 mmol/L K3Fe(CN)6的磷酸鹽測試溶液（0.1 mol/L KCl ＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS）中進行循環伏安（cyclic voltammetry，CV）法掃描，電位差不超過90 mV后，用移液槍移取10 μL制備好的GR-CS復合修飾材料，垂直滴涂于GCE裸電極表面，在室溫下過夜晾干，得到GR-CS/GCE。

1.3.3 免疫傳感器的制備

用移液槍移取10 μL稀釋好的anti-FF，垂直滴涂于GR-CS/GCE表面，立即放入恒溫培養箱中在37 ℃溫育1 h，得到anti-FF/GR-CS/GCE。再移取10 μL的5% BSA溶液，垂直滴涂于anti-FF/GR-CS/GCE表面，37 ℃繼續溫育1 h，得到BSA/anti-FF/GR-CS/GCE，并用CV法對修飾電極進行表征。

將含有FF的待測樣液取10 μL垂直滴涂在BSA/anti-FF/GR-CS/GCE表面，37 ℃進行溫育。采用三電極體系，以BSA/anti-FF/GR-CS/GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，在0～0.6 V電壓范圍內進行差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法掃描測定，在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS測試溶液中進行DPV掃描，記錄峰值電流。

1.3.4 實際樣品的檢測

參照GB/T 20756—2006《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[34]，對預先經檢測無FF的豬肉、牛肉、雞肉、雞蛋（分為全蛋、蛋黃和蛋清3 個測試組）樣品進行預處理。

稱取5.0 g試樣（精確至0.01 g），分別加入FF標準液75 μL，15 mL乙酸乙酯和5 g無水硫酸鈉，均質提取后4 000 r/min離心5 min，用乙酸乙酯定容至50 mL。取10 mL提取液于雞心瓶中，45 ℃旋蒸至干，殘渣用3 mL去離子水溶解并超聲，加入3 mL正己烷渦旋混合，靜置分層，移取1 mL水相于1.5 mL聚丙烯離心管中，13 000 r/min離心5 min，過0.2 μm濾膜后，待測。

取10 μL待測樣液垂直滴涂在BSA/anti-FF/GRCS/GCE表面，按照1.3.3節方法進行DPV掃描，記錄峰值電流。

1.3.5 液相色譜-串聯質譜法檢測FF

C18色譜柱；柱溫40 ℃；流動相為甲醇-水（40∶60，V/V）溶液；電噴霧電離源；掃描方式為負離子模式。

配制質量濃度梯度為1、10、100、200、300、500、700、1 000 ng/mL的FF標準溶液，繪制FF標準曲線。取樣品待測液20 μL進行檢測，并與電化學檢測結果擬合。

1.4 數據統計及圖表繪制

使用Excel進行數據統計和圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 傳感器的制備原理

FF免疫傳感器的制備原理如圖1所示。GCE經拋光打磨處理干凈后，在電極表面垂直滴涂GR-CS，室溫下過夜晾干。再將一定質量濃度的anti-FF包被在電極表面，恒溫溫育后用BSA封閉電極表面剩余的活性位點。將一定質量濃度的FF標準溶液滴涂在電極表面，使FF分子與anti-FF發生特異性結合，電極表面的電子傳遞因抗原-抗體結合產生大分子的結合產物而受到阻礙，從而導致電流發生變化，并以此繪制標準曲線[35]。

圖1 FF免疫傳感器的制備原理圖Fig.1 Schematic of the preparation of immunosensor for florfenicol detection

2.2 GR-CS復合材料的表征

由圖2A可以看出，GR表面存在許多孔穴，使其可以吸附抗體等物質，但卻因其片狀結構而易相互重疊。由圖2B可以看出，CS因其特有的分散性和成膜性，使GR粉末良好地分散，形成一層均勻的導電薄膜。

圖2 GR粉末（A）和GR-CS復合修飾材料（B）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of GR (A) and GR-CS composite (B)

2.3 不同修飾過程中電極的表征

圖3 不同修飾電極的CV曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

采用CV法對不同修飾過程中電極表面的電化學行為進行表征。將不同修飾的電極在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測試液中進行CV掃描，得到CV曲線（圖3）。GCE裸電極（曲線d）經過拋光打磨處理后，出現了一對可逆的氧化還原峰，且峰值電流最小；在GCE電極表面修飾上GR-CS后（曲線a），峰值電流明顯增大，說明電極表面電子傳遞速率得到顯著增強；進一步修飾上anti-FF后（曲線b），峰值電流降低，說明抗體分子阻礙了電極表面電子的傳遞，即anti-FF成功修飾在電極表面；修飾好的電極在5% BSA溶液中封閉1 h后（曲線c），峰值電流進一步減小，說明BSA在電極表面上成功修飾，封閉了電極表面剩余的活性位點，傳感器構建成功。

2.4 抗體質量濃度的確定

電極表面抗體的質量濃度是影響后續FF檢測步驟很重要的因素。為選擇一個最佳的抗體修飾質量濃度，將不同質量濃度的anti-FF垂直滴涂在GR-CS/GCE表面，滴涂量為10 μL，隨后在37 ℃溫育1 h，最后在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測試液中進行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

由圖4可以看出，當anti-FF質量濃度為0～60 μg/mL時，隨著質量濃度的增加，DPV峰值電流迅速降低，表明抗體分子正不斷地被固定在GR-CS/GCE表面；當質量濃度為60～120 μg/mL時，DPV峰值電流的變化趨于平緩，說明電極表面上抗體的固定量已趨于飽和；當質量濃度大于120 μg/mL時，電極表面上的抗體過多，阻礙了電子的傳遞。因此，選擇60 μg/mL為anti-FF的最佳修飾質量濃度。

圖4 不同anti-FF質量濃度下的DPV峰值電流Fig.4 DPV peak currents at different anti-FF antibody concentrations

2.5 溫育時間的確定

在anti-FF/GR-CS/GCE上滴涂10 μL稀釋后的FF標準品溶液，37 ℃溫育時間依次延長，在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測試液中進行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

圖5 不同溫育時間下的DPV峰值電流Fig.5 DPV peak currents at different incubation times

如圖5所示，溫育時間在30～60 min范圍內時，隨著溫育時間的延長，DPV峰值電流不斷增大，這表明免疫反應產物的生成需要一定時間，并隨著時間的延長不斷地進行；當溫育時間繼續延長至60 min以上，DPV峰值電流變化趨于平緩，這表明抗原-抗體的結合反應產物已趨于穩定，免疫反應已基本達到終點。因此，選擇60 min為最佳的溫育時間。

2.6 FF標準曲線建立

在GR-CS/GCE表面分別垂直滴涂10 μL質量濃度為60 μg/mL的anti-FF，37 ℃溫育1 h后用1×PBS清洗，隨后用5% BSA溶液37 ℃封閉1 h，1×PBS清洗后，垂直滴涂不同質量濃度的FF標準溶液，37 ℃溫育1 h后，在測試液0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中進行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

DPV峰值電流與FF質量濃度呈反比，FF質量濃度越大，電極表面上與FF結合的抗體分子越多，生成的結合產物數量增多，導致電極表面電子的傳遞受到空間阻礙，峰值電流越小。在1～1 000 ng/mL范圍內，FF質量濃度（x）與DPV峰值電流（y）的線性關系為y=－0.031 1lnx＋1.470 4，R2=0.983 5，檢出限為0.08 ng/mL（RSN=3）。

2.7 樣品加標回收率

利用1.3.4節樣品前處理方法對豬肉、雞肉、牛肉和雞蛋樣品進行處理。FF的加標量為10、100、1 000 μg/kg，每組樣品重復測定3 次。如表1、2所示，所有樣品的加標回收率在76.90%～94.30%之間，說明本方法構建的電化學免疫傳感器可以用于肉類和雞蛋中FF殘留的檢測。

表1 肉類樣品加標回收率（n=3）Table 1 Recoveries of FF from spiked meat samples determined by electrochemical immunosensor (n= 3)

表2 雞蛋樣品加標回收率（n =3）Table 2 Recoveries of FF from spiked egg samples determined by electrochemical immunosensor (n= 3)

2.8 選擇性和特異性考察結果

選取FF的3 種結構類似物FFA、TAP以及CAP，考察傳感器對于這些藥物的DPV響應。如圖6所示，當在FF標準溶液中分別添加100 倍質量濃度的TAP、CAP以及FFA時，傳感器的DPV峰值電流從低至高依次為FF、FF＋TAP、FF＋CAP、FF＋FFA。電化學免疫傳感器在FF標準溶液及3 種干擾物溶液中的峰值電流分別為1.289×10－4、1.307×10－4、1.352×10－4、1.358×10－4A，表明加入干擾物，電流分別增加1.4%、4.9%和5.3%，這說明免疫傳感器具有良好選擇性。如圖7所示，TAP、CAP以及FFA的添加質量濃度為FF添加質量濃度的100 倍，傳感器的DPV峰值電流大小從低至高依次為FF（1.223×10－4A）、TAP（1.370×10－4A）、CAP（1.394×10－4A）、FFA（1.468×10－4A）；相對于空白對照組（1.481×10－4A），電流分別降低17.5%、7.5%、5.9%和0.9%。

圖6 FF電化學免疫傳感器的選擇性Fig.6 Selectivity of the developed florfenicol immunosensor

圖7 FF電化學免疫傳感器的特異性Fig.7 Specificity of the developed florfenicol immunosensor

圖8 CAP（A）、TAP（B）、FF（C）和FFA（D）的化學結構Fig.8 Chemical structures of chloramphenicol (A), thiamphenicol (B),florfenicol (C) and florfenicol amine (D)

由圖8可知，TAP與FF的結構最為接近，基本基團均為分子兩端的甲苯磺酰基和兩個氯原子以及中間位置的酰胺基團，因此電流變化值最小，與FF的交叉反應率最高；CAP和FF相比，苯環上的磺酰基變為硝基，氟原子變為羥基，但分子另一端的氯原子和酰胺基團不變，因此電流變化值高于TAP，與FF的交叉反應率低于TAP；FFA和FF相比，斷開了酰胺鍵，脫去了羰基和氯原子，相對于TAP和CAP，與FF的結構差異最大，因此電流變化值最大，與FF的交叉反應率最高低。

由此可知，圖6中，加入干擾物后每個實驗組的電流變化值均較小，說明建立的免疫傳感器選擇性良好；圖7中，建立的免疫傳感器對100 倍質量濃度的其他結構類似物的電流變化值較小，說明對FF的特異性較強。

2.9 穩定性實驗結果

將制備好的BSA/anti-FF/GR-CS/GCE于4 ℃保存6 d，每隔24 h測定一次相同電極的DPV峰值電流。峰值電流的變化情況如圖9所示，第6天電極的峰值電流相較于第1天僅下降了11.6%，說明構建的傳感器穩定性良好。

圖9 FF電化學免疫傳感器的穩定性Fig.9 Stability of the developed florfenicol immunosensor

2.10 液相色譜-串聯質譜法對電化學方法的驗證

2.10.1 液相色譜-串聯質譜法檢測實際樣品

表3 肉類樣品加標回收率（n=3）Table 3Recoveries of FF from spiked meat samples determined by LC-MS/MS (n= 3)

配制質量濃度梯度為1、10、100、200、300、500、700、1 000 ng/mL的FF標準溶液，得到FF標準曲線，線性回歸方程為y=170.32x＋67 028，R2=0.999 8，檢出限（RSN=3）為1.0 ng/mL。

根據1.3.4節方法對豬肉、雞肉、牛肉和雞蛋樣品（預先檢測不含FF）進行前處理。FF的加標量為10、100、1 000 μg/kg，每組樣品重復測定3 次。加標回收率結果如表3、4所示，所有樣品的加標回收率在85.60%～101.50%之間，說明前處理方法可行，可以用于動物性食品中FF的檢測。

表4 雞蛋樣品加標回收率（n=3）Table 4 Recoveries of FF from spiked egg samples determined by LC-MS/MS (n= 3)

2.10.2 液相色譜-串聯質譜法與電化學法檢測結果的相關性分析

圖10 電化學和液相色譜-串聯質譜測定結果線性回歸分析Fig.10 Good linear correlation between electrochemical and LC-MS/MS results

由圖10可知，電化學方法和液相色譜-串聯質譜方法的測定結果擬合方程為y=1.080 4x＋2.951 4，R2=0.989 8。因此，本研究建立的電化學免疫傳感器檢測動物性食品中殘留的FF方法準確可靠，可用于現場大量樣品的快速檢測。

3 結 論

本研究制備GR-CS復合修飾材料，利用FF多克隆抗體成功構建了一種基于GR的新型電化學免疫傳感器，用于檢測動物性食品中的FF殘留。在1～1 000 ng/mL范圍內，FF質量濃度與DPV峰值電流呈線性關系，檢出限為0.08 ng/mL（RSN=3），操作簡便，靈敏度高，選擇性、特異性和穩定性均良好，可用于現場大批量樣品的快速檢測。