芽孢桿菌對發酵大豆產生氨基酸和揮發性香氣成分的影響

張 妍，武俊瑞，曹承旭，邱博書，馬 穎，史海粟，楊 慧，烏日娜

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

傳統發酵豆醬是風味獨特且營養價值豐富的發酵大豆類制品[1]。豆醬的風味和品質與其中發酵微生物密切相關[2]，利用對發酵有影響的優勢微生物直接接種發酵，可在不損失營養風味的前提下快速縮短豆醬發酵周期，對優化豆醬發酵品質具有十分重要的意義[3]。

現有研究報道豆醬發酵過程中主要微生物類群有霉菌、酵母菌和細菌[4-5]，Zhang Pengfei等[6]檢測到豆醬醬醅優勢細菌中含有芽孢桿菌。實驗室前期通過宏基因組學研究表明芽孢桿菌與氨基酸形成及香氣物質產生具有一定關系[7-8]，且不同類別及不同含量的氨基酸對豆醬風味物質形成具有一定影響[9]。烏日娜等[10]發現芽孢桿菌可協助真菌分解大豆中的蛋白質和淀粉。續丹丹等[11]認為芽孢桿菌基本貫穿整個豆醬發酵過程[12]，參與物質的分解代謝[13]。Kim等[14]認為中國豆醬中芽孢桿菌為優勢菌；Gao Xianli等[15]研究表明芽孢桿菌為發酵過程中的優勢菌群；Lee等[16]通過一系列分析認為脂肪酸代謝與芽孢桿菌密切相關。

本研究以傳統發酵豆醬中篩選出的具有較強產酶能力的芽孢桿菌作實驗菌，探究芽孢桿菌對大豆發酵過程氨基酸和揮發性香氣成分的影響。通過大豆模擬發酵實驗、游離氨基酸檢測[17]、頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）[18]和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19]對芽孢桿菌發酵大豆樣品所產氨基酸和風味物質進行研究，經因子分析[20]，進一步明確芽孢桿菌對大豆發酵樣品香氣成分具有的貢獻，對優化發酵條件、提高發酵豆醬品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌為本實驗室前期從黑龍江佳木斯、大慶、齊齊哈爾和遼寧朝陽地區傳統自然發酵豆醬中分離篩選所得9 株益生特性、產酶特性良好的菌株，編號為：JMS1-1、JMS1-3、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3、QQHE-2、QQHE-3、CY-1、CY-3。經鑒定分別為枯草芽孢桿菌6 株、地衣芽孢桿菌1 株和解淀粉芽孢桿菌2 株，保藏于實驗室菌種庫。

LB培養基：NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.2～7.4。

三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）、茚三酮、氨基酸混合標樣 德國Sykam公司；NaCl、胰蛋白胨、酵母浸粉、鹽酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；6890N-5973型GC-MS聯用儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌發酵大豆樣品中游離氨基酸分析1.3.1.1 樣品的制備

參考胡美忠等[21]方法對芽孢桿菌進行活化，種子液按2%比例接種于LB培養基中。蒸餾水泡發1 d的豆子，去皮，取100 g處理好的豆子和5 mL蒸餾水于250 mL錐形瓶中，滅菌。以3%接種量將二代芽孢桿菌分別接種于已高溫滅菌的大豆中，做好標記，37 ℃下每12 h扣瓶1 次，固態發酵5 d[22]。

1.3.1.2 樣品前處理

參考張苗等[23]TCA沉淀法和雙縮脲比色法對發酵樣品進行測定。定容后的樣品于47 ℃超聲提取1 h，并以1 700 r/min離心30 min。取2 mL上清液至蒸發皿中蒸干，向其中加入0.02 mol/L鹽酸溶液2.5 mL，充分溶解后過濾，收集的液體即可作為待測液進行上機測定。

1.3.1.3 氨基酸含量計算

式中：Xi為樣品中游離氨基酸含量/（mg/g）；Ci為游離氨基酸檢測量/（nmol/mL）；F為稀釋倍數；V為體積/mL；M為氨基酸分子質量/（g/mol）；m為樣品質量/g。

1.3.2 芽孢桿菌發酵大豆樣品中揮發性風味物質分析

1.3.2.1 發酵樣品揮發性風味化合物萃取

稱取每種芽孢桿菌發酵大豆樣品5 g充分研磨至10 mL頂空瓶底部。對萃取針頭進行老化，以確保除去可能吸附的揮發性成分，將老化好的萃取針頭插入頂空瓶中，通過手柄推出石英纖維頭，使其暴露在頂空瓶頂空氣體中，將頂空瓶放入恒溫60 ℃水浴中萃取30 min。用手柄將石英纖維頭推回針頭內并拔出，然后插入GC-MS儀進樣器中，同時啟動儀器收集數據。

1.3.2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：DB-5MS[24]彈性毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。由室溫升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，降溫至80 ℃，不分流進樣。

質譜條件：離子源在225 ℃全掃描，電離方式為電子電離源，電子能量70 eV；掃描質量范圍m/z33～450。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010、Xcalibur和SPSS 17.0軟件系統對發酵樣品中各揮發性風味物質數據進行分析，采用面積歸一化法對檢測出的化合物相對含量進行確定。

2 結果與分析

2.1 發酵大豆樣品中游離氨基酸分析

以高溫滅菌未接種芽孢桿菌且發酵5 d的大豆作為空白大豆對照組；以傳統工藝發酵成熟豆醬樣品作為發酵成熟豆醬對照組。分別對9 份接種芽孢桿菌大豆發酵樣品和2 份對照組樣品進行檢測，結果如表1所示。

表1 發酵大豆樣品中各游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents in fermented soybeans

從表1可以看出，在芽孢桿菌發酵大豆樣品中共檢測出17 種游離氨基酸，不同菌株發酵樣品間含量差異較大。總游離氨基酸含量由高到低依次為JMS1-1＞JMS2-5＞DQ1-1＞DQ1-3＞QQHE-3＞JMS1-3＞QQHE-2＞CY1＞CY3，JMS1-1發酵樣品游離總氨基酸含量為12.98 mg/g，明顯高于其他8 株發酵樣品，是空白大豆對照組的8 倍，是傳統發酵成熟豆醬對照組的42.53%。發酵樣品中檢測出的天冬氨酸和谷氨酸是豆醬形成鮮味的主要氨基酸，發酵樣品鮮味氨基酸平均值占發酵成熟豆醬樣品23.95%；蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸是形成甜味的主要氨基酸；組氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸是具有微苦的物質，苦味形成相關氨基酸所占比重最大，平均值是發酵成熟豆醬對照組的40.92%；賴氨酸、脯氨酸和半胱氨酸為非呈味氨基酸。由表1可知，芽孢桿菌發酵大豆樣品中，產生苦味和無味氨基酸比重大，鮮味氨基酸其次，甜味氨基酸最少。由于必需氨基酸對人體至關重要，對表1數據進行整理發現，9 份樣品必需氨基酸平均值為2.48 mg/g，是發酵成熟豆醬對照組的31.55%，所占比值較大，推斷芽孢桿菌發酵大豆樣品可產生較多的必需氨基酸，提升豆醬的營養價值。其中JMS1-1發酵樣品必需氨基酸含量最高，為5.23 mg/g，是發酵成熟豆醬對照組的66.54%。

表2 發酵組和空白大豆對照組方差分析Table 2 Analysis of variance for fermented and unfermented soybeans

對上述所得發酵組與空白組數據進行顯著差異分析，結果如表2所示。F=31.351 57＞F0.01（1,78），說明芽孢桿菌發酵樣品相對于空白大豆發酵樣品所產生氨基酸差異極顯著。

綜合上述結果，得出5 株芽孢桿菌在大豆發酵過程中對氨基酸形成起促進作用的優勢菌株，分別為枯草芽孢桿菌JMS1-1、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3菌株和地衣芽孢桿菌QQHE-3菌株，進一步對其揮發性成分種類含量進行測定。

2.2 發酵大豆樣品中揮發性風味物質成分分析

采用HS-SPME-GC-MS對上述5 株芽孢桿菌發酵樣品揮發性香氣成分進行分析，得到總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌產風味物質離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of flavor substances produced by Bacillus

由圖1可看出，5 株芽孢桿菌發酵樣品產物的色譜圖極為相似，發酵產物的出峰時間和峰的強度一致，說明5 株芽孢桿菌產物大致相同。將所得總離子流色譜圖，經質譜檢索分析后，得出揮發性風味物質及相對含量，如表3所示。

表3 芽孢桿菌發酵產物中鑒定出的揮發性風味物質及相對含量Table 3 Volatile flavor substances and their relative contents identified in Bacillus fermented soybeans%

續表3

由表3可知，不同芽孢桿菌發酵樣品所產揮發性風味物質含量和組成不同，相對含量由22.34%～75.77%不等。在5 株芽孢桿菌發酵大豆樣品中共檢測出71 種香氣成分，包含10 種酯類、13 種醇類、6 種醛類、11 種烷類、8 種酸類、5 種酮類和18 種其他類化合物。

5 份發酵樣品中，酯類物質[25]含量最多的為JMS2-5和DQ1-1，物質相對含量為10.34%和18.85%，醇類物質相對含量為21.37%、48.64%、40.52%、5.9%和12.35%。酯、醇類化合物是豆醬發酵過程中重要的香氣成分，5 份樣品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有檢出，但含量各不相同。

5 份發酵樣品中，酮類物質是醛類形成的前體物質，醛可被還原生成醇和酯等化合物[26]。QQHE-3產醛類物質含量最多，相對含量為7.50%；DQ1-1產酮類物質較多，相對含量為8.06%。在5 株芽孢桿菌發酵樣品中均有檢出的烷類化合物分別為六甲基環三硅氧烷、八甲基環四硅氧烷、十甲基環五硅氧烷和十二甲基環六硅氧烷，DQ1-3菌株發酵樣品中含量最高的烷類化合物，相對含量分為36.12%。龐惟俏等[27]認為發酵過程產生的烷烴類化合物可能是微生物的代謝產物，或大豆原料中含有的物質。苯酚類化合物在4 株發酵樣品中均被檢測出，其中JMS2-5菌株所產相對含量相比于其他菌株含量較高，含氮類化合物2-正戊基呋喃在4 株發酵樣品中均被檢測且相對含量較高，苗志偉等[28]認為這種物質為常見的傳統豆醬香氣成分。愈創木酚作為豆醬中常見的香氣物質，在JMS2-5、DQ1-1和DQ1-3中均有檢出。綜上所述，5 株芽孢桿菌發酵大豆樣品所產揮發性香氣成分具有差異，但有利于豆醬風味物質的形成。

2.3 發酵大豆樣品產生的香氣成分因子分析

2.3.1 KMO和Bartlett球形檢驗

為確定不同菌株發酵大豆所產生的揮發性香氣成分數據是否適宜進行因子分析，首先對KMO和Bartlett球形檢驗進行分析，如表4所示。KMO值為0.760，數值在0.5～1之間且接近于1，表明變量間的相關性較大。Bartlett球形檢驗，P=0.000＜0.005，說明數據滿足正態總體分布。因此，芽孢桿菌發酵大豆所產生的揮發性香氣成分數據可進行因子分析。

表4 KMO和Bartlett球形檢驗Table 4 KMO and Bartlett test

2.3.2 芽孢桿菌發酵大豆香氣成分因子分析

用SPSS軟件對數據進行因子分析，由表5可知，前2個因子不旋轉時因子貢獻率分別為54.857%和29.929%，累計貢獻率達到84.786%＞80%，特征值分別為3.840和2.095均大于1，說明這2 個因子包含7 類香氣成分信息[20]，因此，提取2 個公因子較為合適。

表5 優勢菌接種大豆醬香氣成分的特征值和方差貢獻率Table 5 Eigenvalues and variance contributions of aroma components of Bacillus fermented soybeans

由于因子意義不明，本研究采用方差正交旋轉因子模型法，對初始因子進行旋轉，得到因子載荷矩陣和因子得分系數矩陣（表6）。由旋轉后的因子載荷矩陣可以看出，第1公因子酯類（X1）、醇類（X2）、醛類（X3）和烷類（X4）載荷較大，說明這4 類化合物具有較強相關性，也表示芽孢桿菌發酵大豆樣品所產生的香氣成分，酯、醇和醛3 種物質為芽孢桿菌發酵大豆樣品中主要香氣成分。第2公因子酸類（X5）、酮類（X6）和其他類（X7）載荷較大，這幾類在發酵過程中比重較小，但可起自身獨特作用豐富豆醬風味。根據旋轉后因子得分系數矩陣，建立因子得分模型F1、F2。

表6 旋轉后的載荷矩陣和因子得分系數矩陣Table 6 Loading and component score coefficient matrix after rotation

2.3.3 芽孢桿菌發酵大豆香氣成分綜合評價

單獨使用因子F1或因子F2并不能對芽孢桿菌發酵大豆香氣成分作出綜合評價，因此，按各公因子對應的方差貢獻率為權數計算綜合統計量為：F=0.544 72F1＋0.303 14F2。

最后根據所求F值對不同芽孢桿菌發酵的大豆進行排序，見表7。不同芽孢桿菌發酵的大豆所產香氣因子分析排序為：DQ1-1＞JMS2-5＞DQ1-3＞JMS1-1＞QQHE-3。

表7 因子綜合得分Table 7 Synthetic factor scores of Bacillus fermented soybeans

3 討 論

芽孢桿菌具有很強的分解能力，它可以在增殖的同時，釋放出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等，這些可將大分子物質分解成有利用價值的小分子物質[29]。經芽孢桿菌發酵的大豆樣品中游離氨基酸含量明顯升高，9 份發酵樣品總游離氨基酸平均值比空白大豆對照組高出4 倍以上，推測芽孢桿菌的添加通過酶的效果可以使大豆蛋白質分解并轉化為游離氨基酸。芽孢桿菌發酵樣品產生揮發性風味物質成分較多，其中，酯、醇類化合物含量較高，檢測到存在十六烷酸甲酯，有研究表明這種酯類物質對豆醬風味穩定性具有貢獻[27]。發酵樣品中檢測出的3-羥基-2-丁酮物質，有報道表明在豆醬、醬油以及日本味增等發酵產品中被檢出過，且為一種常見的風味物質[30]。產生的苯酚和愈創木酚等物質是豆醬風味形成中常見的香氣物質。5 份芽孢桿菌發酵樣品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有檢出，推測這2 種物質與芽孢桿菌發酵的大豆樣品具有一定相關性。因此，推斷芽孢桿菌對大豆發酵過程游離氨基酸及風味物質的形成具有影響。

從總游離氨基酸含量可以看出，9 份發酵樣品游離氨基酸含量不同，推測不同芽孢桿菌分解產生游離氨基酸量的能力存在差異。發酵樣品產生呈味氨基酸差異較大，苦味氨基酸含量高于其他呈味氨基酸含量。在成熟豆醬對照組中甜味氨基酸含量較多，因此，推測在發酵后期甜味氨基酸形成較多。發酵樣品中異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，這3 種必需氨基酸含量平均值大于發酵成熟豆醬對照組，推斷芽孢桿菌發酵大豆樣品可產生較多的必需氨基酸，提升豆醬的營養價值。5 份芽孢桿菌發酵樣品揮發性風味物質相對含量差異較大，推測不同菌株產香氣能力存在較大差異，發現4 份發酵樣品產醇類化合物最多，而QQHE-3發酵樣品產醛類化合物最多。芽孢桿菌的添加可產生不同種類含量化合物，這些化合物共同作用使整體香氣協調，這與張鵬飛等[1]認為傳統發酵豆醬中酯、醇、醛、酸、酮等物質是豆醬香氣形成的主要成分觀點一致。

4 結 論

綜上所述，采用氨基酸自動分析儀、GC-MS聯用儀對芽孢桿菌發酵的大豆樣品中游離氨基酸和揮發性風味成分進行測定，共檢測出17 種游離氨基酸和71 種揮發性香氣成分。然而，不同芽孢桿菌菌株間存在個體差異，JMS1-1菌株發酵樣品產總游離氨基酸和必需氨基酸含量最多，分別是發酵成熟豆醬對照組的42.53%和66.54%，DQ1-1菌株發酵樣品產香綜合因子得分最高。各發酵樣品中均有乙酸己酯和1-辛烯-3-醇檢出，而豆醬風味形成常見的香氣物質苯酚和愈創木酚也被檢出。因此，推斷芽孢桿菌對大豆發酵過程游離氨基酸及風味物質的形成均發揮著重要的作用。進一步因子分析，認為酯、醇和醛3 類物質為芽孢桿菌發酵大豆樣品中主要香氣成分，這可為生產加工具有良好風味的發酵豆制品，提供參考。