高通量測序分析不同腌臘肉制品細菌多樣性

趙 睿，邵長春，高世功，劉光瑞，楊富民,

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730030；3.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

腌臘肉制品屬非即食肉制品，包括火腿、臘肉、咸肉、臘腸、醬鴨等。腌臘肉的品質和風味與地域微生物區系、加工方式（煙熏、腌制）密切相關。其中湖南產臘肉是典型的煙熏臘肉制品，川渝臘肉在腌制過程中通常加入較多的調味料然后經過烘烤、煙熏加工制作，隴西臘肉屬于甘肅的傳統名吃，隴西臘肉的加工過程主要是腌制56 d左右，風干暴曬20 d左右，而咸肉一般是單純用鹽腌制的肉制品。臘肉的保存期較咸肉長，有特殊的香味。研究不同產品微生物群落結構，對改善其品質、防止亞硝酸鹽超標、延長貨架壽命等有極其重要的意義。陳美春等[1]對四川臘肉微生物進行了研究，發現四川臘肉的主要優勢菌為乳酸菌和葡萄球菌。全拓等[2]對渝臘肉貨架期的微生物變化分析發現，優勢菌主要為葡萄球菌和微球菌，其次是乳酸菌，假單胞菌和腸桿菌數量則較少。陳競適等[3]對湘西陳年臘肉微生物群落研究表明，優勢菌株主要為酵母菌、霉菌、微球菌、霉菌，這可能是湖南臘肉風味的重要組成因素。董蘊等[4]對湖北恩施傳統臘肉的細菌多樣性研究發現，主要為葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和假交替單胞菌屬。但目前對市場上消費量大的臘肉產品微生物群落結構進行比較分析則報道甚少。

高通量測序可快速準確全面地反映不同樣品中微生物群落的組成，可鑒定一些低豐度及不可培養的微生物，16S rDNA擴增子測序技術已成為研究多種樣本中微生物群落組成結構的重要手段[5-9]，但是高通量測序的方法無法對當前臘肉中主要存活微生物的狀況做出正確判斷。采用傳統分離培養與高通量測序技術相結合的方法，可進一步全面準確地鑒定微生物群落，本研究旨在對產自不同地區及不同加工方式的腌臘肉其微生物群落結構之間的共性及差異性進行研究，掌握不同腌臘肉制品細菌多樣性，為其生產及品質控制等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依據市場占有率，選取銷量大的3 類腌臘肉制品（煙熏臘肉、非煙熏臘肉、咸肉）13 個樣品，分別為川渝煙熏臘肉（LR1、LR2、LR3、LR4）（group1）、湖南煙熏臘肉（LR5、LR6、LR7）（group2）、非煙熏甘肅隴西臘肉（LR8、LR9、LR10）（group3）、浙江咸肉（LR11、LR12、LR13）（group4），樣品為生產企業市售產品，生產日期相差不超過10 d，均為真空包裝。

PCA、VRBGA、MRS、BP培養基購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

2550 紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司；S210型pH計 梅特勒-托利多集團；DHG-9410A電熱鼓風恒溫干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SWCJ-1CU超凈工作臺 蘇凈安泰科技有限公司；YXQSG46-280SA蒸汽壓力滅菌鍋 美國致微公司；Phred qualityYQX-II型厭氧培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；HBM-400B型均質機 天津市恒奧科技發展有限公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；5417R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MicroflexTM基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標測定

pH值：依據GB 5009.237—2016《食品中pH的測定》測定；水分：依據GB 5009.237—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法進行測定；食鹽：依據GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》中的間接滴定法。以上同一樣品平行測定3 次。

1.3.2 高通量測序分析

1.3.2.1 樣本微生物總DNA提取

微生物DNA提取采用CTAB方法，取同批次樣品3 份混合，取2 份同時進行測定，稱取混合后樣品1 份180～220 mg于2 mL離心管中，吸取1 000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65 ℃水?。〞r間為2～3 h），期間顛倒混勻數次，以使樣品充分裂解，離心取950 μL上清液，加入與上清液等體積的酚（pH 8.0）-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液至1.5 mL離心管，加入上清液3/4體積的異丙醇，上下搖晃，－20 ℃沉淀。12 000 r/min離心10 min，倒出液體。用1 mL 75%乙醇溶液洗滌2 次，剩余的少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出。室溫晾干，加入51 μL ddH2O溶解DNA樣品，加RNase A 1 μL消化RNA，37 ℃放置15 min。之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。

1.3.2.2 16S rDNA擴增及Illumina NovaSeq測序

以提取的基因組DNA為模板，通過引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）、806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）擴增16S rDNA V3-V4，PCR擴增循環條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃終延伸5 min，擴增40 個循環。擴增結束后，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對于符合條件的PCR產物進行純化回收，回收產物的文庫構建采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒，利用Illumina NovaSeq測序平臺進行上機測序。

1.3.2.3 高通量測序數據分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列拆分各樣本數據，截去Barcode和引物序列，FLASH（V1.2.7）[10]拼接獲得的高質量Tags數據，利用Uparse[11]（Uparse v7.0.1001）軟件對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類，默認97%的一致性，選取OTU的代表性序列，用Mothur方法與SILVA132[12]的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1）。采用Qiime軟件[11]（Version 1.9.1）進行α多樣性分析，并對不同樣品檢測結果進行韋恩圖繪制，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線，用R軟件進行α多樣性指數組間差異分析。根據物種注釋，統計每個樣品在門（相對豐度＜0.1%及unidentified歸入others）、屬（相對豐度＜5%及unidentified歸入others）分類水平上的序列數目。熱圖使用R語言繪制。

1.3.3 傳統分離培養

1.3.3.1 微生物培養分離

取同批次樣品3 份，攪碎混勻，稱取混勻后的樣品2 份各25 g同時進行測定，置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器8 000 r/min均質5 min，制成1∶10的樣品勻液，后進行10 倍倍比稀釋，并取0.1 mL涂布于制備好的PCA、VRBGA、MRS、BP（加入5%亞碲酸鉀卵黃增菌液）培養基上，在不同培養培養基上的主要培養條件如下：PCA培養基30 ℃培養48 h，MRS培養基放入厭氧袋中（海博）30 ℃厭氧培養48 h，BP培養基放入37 ℃培養48 h。選取菌落數在30～300 CFU之間的PCA平板、菌落數在15～150 CFU之間的其他平板，隨機挑取10 個菌落，純化2 次后，用于后續鑒定分析。

1.3.3.2 MALDI-TOF MS鑒定

鑒定菌落樣本采用MALDI-TOF MS儀，樣品制備采用擴展直接轉移法，使用接種環挑取單個菌落，直接涂抹到MALDI靶板上，形成薄層，將1 μL 70%甲酸溶液滴加覆蓋在每個樣本上，室溫晾干，將1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸仔細滴加覆蓋在每個樣本，室溫晾干，后進行上機測試。數據圖譜用FlexControl 3.4采集，結果用Biotyper 3.0 database處理分析。得分不低于2.0表明鑒定結果在種水平上可靠，得分1.7～2.0在屬水平上可靠。

2 結果與分析

2.1 不同腌臘肉制品理化指標測定結果

表1 不同腌臘肉制品理化指標Table 1 Physicochemical properties of different styles of traditional Chinese bacon

由表1可知，腌臘肉樣品中川渝臘肉的水分含量最高，與其他組別相比差異顯著，湖南煙熏臘肉及隴西非煙熏臘肉水分差異不顯著，浙江咸肉中水分含量最低，不同地區腌臘肉樣品的pH值結果差異不顯著，浙江咸肉及隴西臘肉中NaCl含 量高，與其他組相比差異顯著。

2.2 分離培養結果

表2 腌臘肉樣品可培養細菌分布情況Table 2 Distribution of culturable bacteria in traditional Chinese bacons

MALDI-TOF MS可鑒定至種屬水平的分離結果見表2。13 種銷售的腌臘肉商品中共分離得到了99 株菌株，位居前3的是腐生葡萄球菌株占27.3%，大腸埃希菌株占24.2%，馬葡萄球菌株占14.1%，其余依次為類干酪乳桿菌、清酒乳桿菌、屎腸球菌。對不同地區樣品微生物分離株總數及不同菌種占比進行分析，川渝煙熏臘肉共分離到26 株菌，其中大腸埃希菌及腐生葡萄球菌占比最高為38.5%和34.6%。湖南臘肉分離得到24 株菌，腐生葡萄球菌占比最高為54.1%，隴西臘肉中共分離到23 株菌，葡萄球菌屬及乳桿菌屬均為9 株。浙江咸肉中共分離到25 株菌，其中未分離到葡萄球菌屬細菌，分離到類干酪乳桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、液化沙雷菌、克氏庫克菌分別為7、6、5、4、3 株，與其他地區分離菌株種類數量差異較大。表明不同產地煙熏及不同種類的腌臘肉其菌株類型、數量之間存在明顯差異。臘肉腌制過程因雖然加入了一定的鹽分，但葡萄球菌由于具有較高的耐鹽特性，得以大量生長繁殖。此外，腌臘肉樣品中還分布有少量的機會致病菌，如克氏庫克菌屬細菌。

2.3 高通量測序數據統計與質量分析

13 份樣品共產生751 737 條有效序列，平均長度約為419 bp，由稀釋曲線（圖1A）可見，測序序列數大于30 000時，曲線上升緩慢，表明測序數據量繼續加大，新增OTU數空間有限。等級聚類曲線（圖1B）表明，樣品微生物豐度和均勻度存在顯著差異，其中川渝煙熏臘肉LR1、LR2、LR3、LR4樣品曲線較陡峭、水平跨度小，微生物豐度、均勻度低。

圖1 16S rDNA高通量測序樣本的多樣性曲線Fig.1 Microbial diversity curves of the tested samples based on highthroughput sequencing of the 16S rDNA gene

2.4 樣品OTU統計分析

按照97%相似度對所有序列進行聚類分析，共獲得3 105 個OTU，涵蓋37 個門，665 個屬，468 個種。由圖2可知，川渝煙熏臘肉的4 個樣品（LR1、LR2、LR3、LR4）的OTU數最少，在239～630之間，而同樣為煙熏臘肉的湖南地區樣品OTU數量卻較高，OTU數在1 139～1 392之間，其原因可能是地域微生物差異所致。甘肅隴西臘肉樣品OTU數在758～1 352之間，浙江地區咸肉樣品OTU數在711～978之間，可見非煙熏、咸肉與煙熏腌臘肉制品在微生物群落組成上存在較大差異。

圖2 不同樣品OTU數與分布圖Fig.2 Distribution of OTUs number in different samples

韋恩圖展示了不同組別微生物群落的相似性及差異性，由圖3可見，川渝煙熏臘肉、湖南煙熏臘肉、甘肅隴西臘肉、浙江咸肉樣品OTU總數分別為934、1 795、1 486、1 526 個，其中獨有的OTU數分別為98、517、314、717 個。浙江咸肉獨有的OTU數占所有OTU的46.99%，占比最高，表明咸肉與臘肉相比在微生物區系上存在明顯不同。

圖3 不同組樣品共有和獨有OTU韋恩圖Fig.3 Venn diagram of unique and shared OTUs of the bacterial communities in different samples

2.5 α多樣性指數分析

表3 腌臘肉樣品中細菌α多樣性Table 3 Diversity indexes of bacterial communities in traditional Chinese bacon samples

對不同樣本在97%一致性閾值下的α多樣性[14]指數進行統計，結果見表3。所有樣本的Coverage指數均大于0.99，說明測序結果可信。但川渝煙熏臘肉Simpson指數和Chao1指數均較低，其菌落豐度及多樣性水平相對較差。

2.6 門水平菌群結構

圖4為各樣品豐度最高的前10柱形圖。優勢物種分別為厚壁菌門（Firmicutes）平均占比64.19%、變形菌門（Proteobacteria）平均占比24.89%、放線菌門（Actinobacteria）平均占比4.02%，其余為擬桿菌門、酸桿菌門、藍藻細菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、梭桿菌門以及其他未知分類（unclassified）以及未知細菌菌門（unidentified_Bacteria）。雖然主要優勢菌門基本相同，但是相對豐度差異較大。川渝煙熏臘肉LR1、LR2、LR3、LR4樣品厚壁菌門占比達95.24%～99.20%，是絕對優勢菌門；湖南煙熏臘肉LR5、LR6、LR7分別為64.18%、52.42%、71.14%，說明不同地區煙熏臘肉的微生物組成存在差異。咸肉樣品及未煙熏臘肉樣品主要為2～3菌門占優勢，占比相對較均衡，與煙熏臘肉相比微生物種類更為豐富。

圖4 門水平的不同臘肉樣品相對物種分布相對豐度Fig.4 Distribution of microbial communities in different traditional Chinese bacon samples at the phylum level

2.7 屬水平菌群結構

在屬的水平上統計（圖5）顯示，不同臘肉樣品中位于前10 位的菌屬有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、棒狀桿菌屬（unidentified_Corynebacteriaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus）、弧菌屬（Vibrio）、環絲菌屬（Brochothrix）、穩桿菌屬（Empedobacter）。

由圖5可知，川渝產煙熏臘肉樣品（LR1、LR2、LR3、LR4）菌相較為單一，葡萄球菌屬比例達到87.33%～97.35%；而湖南產煙熏臘肉樣品的菌落組成較為豐富，3 份臘肉樣品優勢菌屬組成和比例均不相同，其中LR5的優勢菌屬為乳球桿菌占比35.84%，LR6為葡萄球菌屬占比29.90%，LR7樣品優勢菌屬為乳桿菌屬占比37.37%，說明不同臘肉樣品的微生物群落組成存在差異。未煙熏臘肉樣品LR8的優勢菌屬為嗜冷桿菌屬占比28.46%，其次為乳桿菌屬占比25.43%；LR9樣品優勢菌屬為葡萄球菌屬占比83.96%；LR10樣品優勢菌屬為不動桿菌屬占比22.50%，其次為嗜冷桿菌屬占比16.08%；未煙熏臘肉微生物群落結構之間的差異可能是由于配料、加工方法、環境不同。由圖5可見，咸肉樣品的微生物菌落結構較為豐富和相似，但與臘肉相比微生物群落結構差異較大。咸肉樣品LR11占比高的3 個菌屬為不動桿菌屬（24.46%）、乳桿菌屬（18.39%）、葡萄球菌屬（4.93%），LR12為不動桿菌屬（32.51%）、葡萄球菌屬（11.20%）、乳球菌屬（10.46%），LR13為葡萄球菌（36.81%）、不動桿菌屬（13.48%）、棒狀桿菌屬（13.48%）。葡萄球菌屬在所有臘肉樣品中均存在，但比例不同。腌臘肉中葡萄球菌屬的大量存在，可能是由于葡萄球菌對于高鹽以及其他復雜環境具有較好的耐受力。此外，葡萄球菌屬也是臘肉特殊香味產生的來源之一[7,15]。乳酸菌同樣在每個臘肉樣品中檢出，乳酸菌在肉制品發酵過程中起著非常關鍵的作用，可將碳水化合物轉化為乳酸，降低臘肉pH值，改善臘肉品質，延長保質期[16]。

圖5 屬水平的不同臘肉樣品相對物種分布相對豐度Fig.5 Distribution of microbial communities in traditional Chinese bacon samples at the genus level

2.8 基于屬水平不同樣品比較熱圖分析

在屬分類水平上，取排名前25的屬得到物種分類聚類熱圖，通過熱圖板塊顏色深淺判斷不同樣品及不同分組樣品之間微生物組成的差異，圖6A顯示，4 個不同分組樣品在屬水平的微生物群落結構差異較大，每個組別的微生物群落組成及優勢菌屬均不相同。圖6B表明，川渝煙熏臘肉4 個樣品菌落結構中除LR3存在高占比魏斯氏菌屬（Weissella）外，其余均為葡萄球菌屬為主要優勢菌屬。湖南煙熏臘肉、隴西非煙熏臘肉、浙江咸肉樣品菌落結構較為豐富，存在多個優勢菌群，每個組內的樣品雖然菌落結構較為相似，但其含量不同，組內各個樣品間存在一定差異，表明地域環境、原材料、加工方式不同，腌臘肉制品中微生物群落結構存在多樣化。

圖6 不同腌臘肉樣品屬水平分布熱圖Fig.6 Heatmaps of genus-level distribution of bacterial communities in different traditional Chinese bacon samples

3 討 論

腌臘肉是中國傳統發酵肉制品，歷史悠久、地方特色突出。不同地域因環境、氣候、飲食習慣及喜好不同，形成了各具特色的腌臘肉制品。不同種類的腌臘肉又因原料、加工方式不同，其品質、風味不同。影響腌臘肉制品品質的因素很多，但微生物菌群組成是其重要因素之一，菌落結構不但影響理化特性、風味，而且影響其貨架壽命，關乎食品安全[2,4,17]。

本研究基于16S rDNA基因高通量測序技術及傳統分離培養的方法，研究不同地區、不同加工方式腌臘肉制品的微生物菌落多樣性情況，根據高通量測序結果對13 份腌臘肉進行菌相分析，結果表明不同地區煙熏臘肉樣品、未經煙熏臘肉樣品、咸肉樣品微生物菌落結構各有差異。川渝煙熏臘肉樣品的優勢菌群主要是葡萄球菌屬，湖南煙熏臘肉樣品微生物結構更為豐富，乳桿菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬在不同樣品中占比不同，這與前期其他研究學者對于臘肉樣品微生物群落研究結果基本一致[18-20]，葡萄球菌屬及乳桿菌屬由于較高的耐鹽性因此在不同種類腌臘肉樣品中都有不同比例的存在。其中乳酸菌能夠抵抗加工肉制品中煙熏和亞硝酸鹽的抑菌作用，能耐受較高濃度的鹽，因此在發酵肉中廣泛存在。此外，這兩種菌也是腌臘肉制品特殊香氣產生的重要微生物[21-23]。非煙熏的甘肅隴西臘肉樣品微生物結構基本相同，但組成比例具有較大差異，嗜冷桿菌屬（Psychrophilus）、不動桿菌屬、葡萄球菌屬在不同樣品中分別占據優勢菌屬，王海燕等[24]在對湖南臘肉發酵過程中的細菌群落研究發現，煙熏對微生物結構會有較大的影響，所以非煙熏樣品與煙熏樣品的微生物結構存在差異。隴西臘肉未煙熏，腌制過程較長需要56 d，并且曬20 d，加工方式差異可能是導致其群落結構不同的原因。在煙熏、非煙熏臘肉樣品中都含有較高比例乳酸菌，主要原因可乳酸菌在發酵過程中還會產生一些抑菌物質，包括乳桿菌素、乳鏈球菌肽等也會抑制其他微生物的生長。不同腌臘肉制品中的微生物菌落結構還與初始原料中微生物的污染程度及加工中的環境衛生狀況相關。

咸肉樣品中均存在不動桿菌屬，且占比較高在13.48%～32.51%之間。不動桿菌屬是生鮮肉制品中常見的微生物菌屬之一[25-27]，分析原因可能是咸肉的加工方式由于加工步驟較少，僅為鹽漬腌而缺少晾曬，所以與新鮮肉中的微生物菌落結構更為接近。腌制、熏制等加工過程會使得導致原料肉腐敗的革蘭氏陰性細菌大大減少，而只剩下一些能適應這種特殊腌制環境的革蘭氏陽性菌得以生長，因此腌制、熏制過程抑制了多數微生物的生長從而使得腌臘肉的產品保質期更為長久。在隴西臘肉中分離了共6 株清酒乳桿菌，清酒乳桿菌能耐受高鹽及較低的溫度，同時是腌臘肉制品特殊風味的來源，但是大量乳酸菌存在時會導致產品的腐敗，乳酸菌含量在多大范圍會增加風味或引起腐敗還需要進一步研究[28]。

研究中還發現一些菌屬特定存在于某些樣品中，如弧菌屬在LR7樣品中占比較高，棒狀桿菌在LR13樣品中占比較高，而這兩種菌屬屬于可能會產生致病性的菌屬[29-30]，嗜冷桿菌屬在未煙熏LR8、LR10中占比較高，嗜冷桿菌是典型的耐寒性好氧菌，可產生脂肪水解酶，導致油脂水解，使產生腥臭味和霉味[31-32]。

4 結 論

研究采用高通量測序與傳統分離鑒定相結合，傳統分離培養獲得了99 株可培養微生物，高通量測序獲得了751 737 條有效序列數，12 122 個操作分類單元，更好地揭示了不同腌臘肉制品微生物群落的多樣性。由于類別不同煙熏臘肉、未煙熏臘肉、咸肉微生物菌落結構存在明顯的差異，其中煙熏臘肉樣品葡萄球菌屬占優勢，非煙熏臘肉嗜冷桿菌屬、不動桿菌屬、葡萄球菌屬占據優勢菌屬，咸肉中不動桿菌屬則為占比高的優勢菌屬。因地域及加工方法不同川渝煙熏臘肉樣品葡萄球菌屬占絕對優勢，而湖南產煙熏臘樣品除葡萄球菌屬外，優勢菌屬還有乳酸菌屬和乳球菌屬。所檢測到的弧菌屬、棒狀桿菌、嗜冷桿菌等機會致病菌，在生產中應引起重視。