pH值對麥醇溶蛋白-槲皮素相互作用及其Pickering乳液特性的影響

王啟明，唐瑜婉，楊雅軒，劉士健，趙吉春，張宇昊，明 建,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

槲皮素是一種廣泛分布在果蔬、谷物中的重要黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂等生物活性及藥理學作用[1-2]，大量的酚羥基結構賦予其獨特的化學特性，如能與生物大分子（蛋白質、多糖等）發生相互作用[3-4]。麥醇溶蛋白是小麥中的主要貯藏蛋白，能賦予面團黏性，具有兩親性，可自組裝形成膠體顆粒，在Pickering乳液中起乳化和穩定作用[5]。

在食品加工過程中，蕎麥粉和小麥粉常混合食用，槲皮素和麥醇溶蛋白之間的相互作用，會引起蛋白結構和功能特性的改變。食品組分間復雜的相互作用形成復合顆粒結構，可操控食品結構（如乳液、泡沫體系等）的形成[6-7]。相關研究報道植物多酚（蘆丁[8]、姜黃素[9]、單寧酸[10]等）與植物蛋白質（大豆分離蛋白[8-9]、玉米醇溶蛋白[10]等）的復合改變了蛋白質理化性質，且復合顆粒對乳液的穩定性、流變學特性和微觀結構也產生了明顯的作用。

乳液具有改善食品風味、提升營養品質等應用潛力，逐漸成為研究的熱點，但其特性常受多種因素（如pH值、離子強度、溫度等）的影響。其中，蛋白質和多酚的表面電荷會隨pH值變化，從而影響相互作用類型和乳液的特性[11-12]。Chen Shou等[9]報道了在pH 3.0和pH 7.0條件下，姜黃素與大豆分離蛋白的絡合明顯促進乳液的脂質氧化。Zhou Fuzhen等[13]研究發現，pH 4.0條件下小麥醇溶蛋白和原花青素復合顆粒制備的乳液具有黏彈性和超穩定性。然而對于特定pH值條件下，麥醇溶蛋白-槲皮素的相互作用及其荷載前后蛋白制備Pickering乳液的基礎特性尚不清楚。

因此，本實驗利用反溶劑法制備麥醇溶蛋白-槲皮素復合物，研究pH值對蛋白及其復合物性質的影響，并探究pH值對荷載前后蛋白制備Pickering乳液的流變學性質及微觀結構的影響，以期拓寬兩者在小麥制品中的應用范圍，為開發富含生物活性物質的高蛋白食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥醇溶蛋白（Lot#SLBS6538）、槲皮素（≥95%，色譜純，Lot#SLBV2993） 美國Sigma公司。

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、溴酚藍、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設備

F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；Pro10102掃描電鏡 荷蘭Phenom Pro公司；DSC25差示量熱掃描儀美國TA公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份公司；TGL-18MS高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松原華興科技有限公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕公司；BX53熒光正置顯微鏡 日本Olympus公司；LSM800激光共聚焦顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

通過反溶劑法制備麥醇溶蛋白及其復合物麥醇溶蛋白-槲皮素分散液，參考Hu Yaqiong等[14]的方法略作修改。在磁力攪拌條件下將1.0 g麥醇溶蛋白和7.5 mg槲皮素溶解在100 mL體積分數70%乙醇溶液中，超聲輔助溶解。然后在4 ℃貯存過夜以完全水合。在反溶劑過程，水相與醇相體積比為2.5∶1。將麥醇溶蛋白溶液緩慢滴入1%冰乙酸溶液中，邊滴邊均質（10 000 r/min、3 min）。均質完成后，所得溶液在45 ℃水浴下旋轉蒸干。在沒有槲皮素的情況下相同條件制備麥醇溶蛋白溶液。調節溶液pH值，得到pH 3.0、5.0、7.0的分散液，冷凍干燥，備用。

1.3.2 熒光猝滅測定

吸取1 mL不同pH值的麥醇溶蛋白-槲皮素復合溶液（混合前，麥醇溶蛋白濃度為10 μmol/L，槲皮素濃度梯度為0、5、10、20、30、60、100 μmol/L）。分別在20、30、40 ℃測定。激發波長285 nm，掃描范圍為300～500 nm。參考Lakowicz[15]的方法校正內濾光效應。

1.3.3 表面疏水性測定

參考Tang Yu等[16]溴酚藍法進行測定。將1.0 mL樣品（10.0 mg/mL）與1.0 mL磷酸鹽緩沖液（50.0 mmol/L，pH 7.0）和200 μL（1.0 mg/mL）溴酚藍充分混合，旋渦10 min。以磷酸鹽緩沖液為空白，使用分光光度計在波長595 nm處測量離心后上清液（稀釋10 倍）吸光度（A）。溴酚藍結合量按下式計算：

1.3.4 掃描電鏡觀察

取適量固體粉末，經噴金處理后在10 kV加速電壓下掃描，觀察樣品的微觀結構。放大倍數為3 000 倍和8 000 倍。

1.3.5 差示掃描量熱測定

參考Tang Yu等[16]的方法，略作修改。稱量2.0 mg固體粉末密封在差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）鋁盒中，在40～100 ℃溫度范圍內以10 ℃/min進行升溫。采用TA儀器自帶TRIOS軟件分析獲得變性峰溫度Tp，代表蛋白質的熱穩定性。

1.3.6 乳液制備

參考Hu Yaqiong等[14]的方法，采用簡單的均質乳化法制備乳液。粒子質量濃度為5.0 mg/mL，研究pH 3.0、5.0條件下乳液的形成及性能。油相為大豆油，油水比為體積比1∶1，10 000 r/min均質3 min得到乳液。

1.3.7 乳液類型判斷

通過觀察乳液滴到水或油里的分散情況判斷乳液的類型（O/W或W/O）。乳滴分散在水中，則為水包油（O/W）型乳液；反之，則為油包水（W/O）型乳液。

1.3.8 乳液的穩定性分析

離心穩定性：觀察乳液10 000 r/min離心2 min后的狀態判斷。貯藏穩定性：觀察室溫下乳液靜置后乳析層的變化判斷。

1.3.9 乳液流變學行為分析

參考Zou Yuan等[10]的方法，略作修改。采用安東帕流變儀測定乳液的流變學行為，選用d=50 mm的平行板，設置間隙為0.104 mm。黏度測量：剪切速率為0.1～100 s－1。黏彈性質測量：頻率掃描范圍為0.1～100 Hz，應變為0.5%；應力掃描范圍為0.01%～100%，頻率為1 Hz。

1.3.10 乳液的微觀結構觀察

參考Hu Yaqiong等[14]的方法，略作修改，進行乳液微觀結構的觀察。

光學顯微鏡：將10 μL樣品置于載玻片上放大40 倍觀察乳液的形態。使用顯微鏡自帶軟件分析液滴尺寸分布：對每個樣品乳液的3 張圖像進行100 次液滴測量，并將平均值作為該條件下的平均液滴尺寸。

激光共聚焦顯微鏡：配制含有0.2%尼羅紅（異丙醇溶解）和0.2%尼羅藍（去離子水溶解）的染料。將1 mL乳液與20 μL尼羅紅和20 μL尼羅藍混合均勻。將10 μL乳液置于載玻片上放大40 倍觀察乳液的形態。激發波長分別為488 nm和633 nm。

1.4 數據統計及分析

所有實驗至少進行3 次重復，利用MiniTab 17軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，置信區間為95%。采用SigmaPlot 12.5軟件進行圖表處理。

2 結果與分析

2.1 熒光猝滅分析

蛋白質固有的熒光團（色氨酸和酪氨酸）對其微環境的極性高度敏感。如圖1所示，在未加槲皮素時，不同pH值溶液下麥醇溶蛋白在波長340 nm左右有最強熒光發射峰，而隨著槲皮素的加入及濃度的增大，熒光強度降低且伴隨著明顯的藍移現象（pH 3.0：339～321 nm；pH 5.0：339～327 nm；pH 7.0：341～333 nm），表明槲皮素與麥醇溶蛋白間存在相互作用，氨基酸附近微環境極性減弱，疏水性增強。在pH 3.0、5.0和pH 7.0條件下，槲皮素對麥醇溶蛋白的的猝滅率分別為84.50%、85.95%和87.08%，猝滅效應強度為pH 3.0＞pH 5.0＞pH 7.0，表明pH值影響槲皮素對麥醇溶蛋白的猝滅作用。

圖1 不同pH值條件下槲皮素對麥醇溶蛋白的熒光猝滅效應Fig.1 Fluorescence quenching effect of Q on G at different pH values

圖2 不同溫度下槲皮素猝滅麥醇溶蛋白的Stern-Volmer圖Fig.2 Stern-Volmer plot for wheat gliadin quenching by quercetin at different temperatures

通過Stern-Volmer方程進行熒光猝滅數據的分析。如圖2所示，F0/F和[Q]（Q為槲皮素）之間存在線性相關性，斜率隨著溫度的升高呈增加趨勢，說明槲皮素與麥醇溶蛋白之間發生了動態猝滅現象。通過無熒光猝滅劑狀態下的平均熒光壽命τ0（一般為10－8s）和猝滅常數Ksv得到雙分子猝滅速率常數Kq（Ksv=10－8×Kq），如表1所示，其值在7.86×1012～1.22×1013L/（mol·s）之間，遠大于最大動態猝滅速率2.0×1010L/（mol·s），說明相互作用過程中也存在靜態猝滅現象，所以槲皮素對麥醇溶蛋白的猝滅方式為動、靜態結合，麥醇溶蛋白的猝滅結果與Joye等[17]報道的一致。如圖3所示，lg[（F0－F）/F]-lg[Q]的雙對數關系提供了有效猝滅常數Ka和化學計量數n的信息，其值列于表1。pH 5.0條件下Ka較大，表明此條件下槲皮素更易于與麥醇溶蛋白形成復合物[18]。各條件下n約為1，表明槲皮素與麥醇溶蛋白之間至少有一個結合位點。

表1 麥醇溶蛋白-槲皮素復合物在不同pH值和3 個溫度下的猝滅常數和熱力學參數Table 1 Quenching constants and thermodynamic parameters for the formation of wheat gliadin/quercetin (G-Q) complexes at different pH values and temperatures

圖3 不同溫度下槲皮素猝滅麥醇溶蛋白的雙對數圖Fig.3 Double logarithmic plot for wheat gliadin quenching by quercetin at different temperatures

通過熱力學參數（自由能變化（ΔG）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS））的正負關系判斷槲皮素與麥醇溶蛋白之間的主要結合力。根據Ross等[19]的結果，ΔH＞0且ΔS＞0，為疏水作用；ΔH＜0且ΔS＜0，為范德華力和氫鍵；ΔH＜0且ΔS＞0，為靜電相互作用。由表1可得，pH 3.0條件下，槲皮素與麥醇溶蛋白之間主要為疏水作用力；而pH 5.0和pH 7.0條件下，槲皮素與麥醇溶蛋白之間主要為氫鍵和范德華力。而所有pH值條件下ΔG均小于0，表明槲皮素與麥醇溶蛋白的結合為自發過程。不同pH值條件下，麥醇溶蛋白的帶電程度和槲皮素的解離度差異顯著影響著槲皮素與麥醇溶蛋白的相互作用[4]。

2.2 表面疏水性分析

溴酚藍可與低水溶性蛋白質的疏水位點結合，溴酚藍的結合量越高，表明疏水性越強。如表2所示，添加槲皮素后，復合物的溴酚藍結合量更大，說明酚類化合物的疏水羥基促進了蛋白疏水性位點的暴露，與熒光光譜分析結果一致。對于麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素體系，溴酚藍結合量均為pH 3.0＞pH 5.0＞pH 7.0，原因可能是pH 3.0條件下蛋白內部非極性氨基酸的暴露更有利于溴酚藍與蛋白質的結合，與陳碩等[18]測定的結果一致。

表2 pH值對麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素表面疏水性的影響Table 2Effect of pH on surface hydrophobicity s of G and G-Q complex

圖4 不同pH值條件下麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素電鏡圖Fig.4 Electron micrographs of G and G-Q complexes at different pH values

如圖4所示，麥醇溶蛋白分子間有空隙，冷凍干燥過程中易形成裂紋或氣孔。麥醇溶蛋白體系中，蛋白表面有裂紋，能觀察到少量顆粒（箭頭所指處），正如Sun Shaomin等[20]描述的這些球晶狀顆粒可能是聚集的小麥醇溶蛋白。隨著pH值的升高，蛋白網絡結構更致密；pH 5.0和pH 7.0條件下，蛋白表面氣孔小且多，蜂窩狀具有良好的物理截留作用[21]，表明槲皮素的添加和pH值的改變導致了蛋白結構的差異。

2.3 差示掃描量熱儀分析

圖5 不同pH值下麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素差示掃描量熱分析圖Fig.5 DSC thermograms of G and G-Q complexes at different pH values

如圖5所示，麥醇溶蛋白體系中，最大峰值溫度為66.64 ℃（pH 3.0），隨pH值的升高，Tp降低，pH 5.0時，Tp降至58.60 ℃，pH 5.0條件下，蛋白的變性峰開始變窄，表明蛋白質分子的變性方式更協同[22]。添加槲皮素，熱穩定性略微降低，表明相互作用可能破壞分子內疏水和靜電力導致蛋白結構的去穩定化，與Cao Yanyun等[23]的研究結果一致。仇超穎[24]的研究指出，小麥醇溶蛋白球狀結構的出現可能導致其相對高變性溫度（pH 7.0），本研究掃描電鏡結果顯示，pH 7.0條件下確有球狀顆粒的蛋白出現。結果表明，pH值導致蛋白熱穩定性以及熱變性方式的變化，pH值似乎是影響多酚-蛋白質相互作用模式的關鍵因素，仍需進行深入探討。

2.4 乳液類型判斷及乳液穩定性分析

將不同條件下的乳液滴到水中后（圖6A），液滴快速分散，證明各乳液是O/W型乳液。貯藏穩定性是乳液的關鍵參數，因為它在某種程度上決定產品最終能否被使用。乳液的貯藏穩定性通過乳析指數（乳液中水相高度與乳液總高度的比值）評價。圖6B、C顯示乳液的典型外觀。pH 3.0條件下制備的新鮮乳液具有類似牛奶的流動性，無乳析現象；而pH 5.0條件下制備的新鮮乳液呈類似蛋黃醬的膏狀（圖中未顯示）。由于貯藏期間的密度梯度，乳液靜置1 h后，乳析指數在20%左右（圖6B）。隨著靜置時間的延長，界面高度隨之增加。貯藏7 d后，對于pH 3.0的乳液，乳析指數增加到35%，乳液不像凝膠那樣堅硬，但其流動性不如液體；而pH 5.0的乳液，乳析指數基本未變（圖6C）。pH 5.0條件下底部水相是透明的，表明顆粒吸附在油水界面，且有些顆粒遷移到了油相[25]。Wang Lijuan等[26]制備了玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米顆粒穩定的乳液，乳液貯藏9 個月后也觀察到了這一現象，表明乳化并未導致乳液發生不可逆的聚結。實驗結果證明，pH 5.0條件下的乳液乳析指數更低，貯藏穩定性更好，且pH 5.0條件下的乳液在均質完后迅速變成固體狀的乳液凝膠狀，提高了乳液的貯藏穩定性，與Hu Yaqiong等[14]的研究結果相符合。

圖6 不同pH值條件下麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素的Pickering乳液Fig.6 Pickering emulsions stabilized by G and G-Q particles at different pH values

乳液離心后，出現嚴重排水現象，乳析指數約50%，在離心力作用下，乳滴迅速聚集，比貯藏90 d后的乳析指數稍高（圖6D）。pH 3.0、pH 5.0的乳液均未觀察到破乳漏油現象，這一結果與貯藏穩定性結果一致，進一步說明pH 3.0、pH 5.0條件下的乳液耐受離心力。

2.5 乳液的流變學性質

乳液呈現表觀黏度隨剪切速率的增大而減小的剪切稀化現象，如圖7A、B所示。同一pH值條件下，槲皮素的加入使表觀黏度增大。在1 s－1時，pH 3.0、5.0條件下復合顆粒穩定乳液的表觀黏度分別是蛋白顆粒的10 倍和100 倍，表明槲皮素在一定條件下能增強乳滴的絮凝作用。經過10 000 r/min離心后，乳液仍為剪切稀化狀態，但表觀黏度均比新鮮乳液大，表明乳液經過離心后，乳滴間的絮凝作用增強，正如鄒苑[27]報道的離心可以產生具有黏彈性的乳液結構，這也進一步證明乳液耐受離心。

圖7 不同pH值條件下麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素Pickering乳液的流變學性質Fig.7 Rheological behaviors of Pickering emulsions stabilized by G and G-Q particles at different pH values

如圖7C所示，對于所有的測試乳液，其儲能模量（G’）大于損耗模量（G’’），特別是pH 5.0條件下的乳液，G’約為100 Pa，超過了G’’的10 倍，表明形成了以彈性為主的凝膠網絡結構乳液。有無槲皮素的乳液，G’和G’’值均隨頻率增加而增大。但在同一頻率下，復合顆粒穩定乳液的G’和G’’大于同等pH值條件下蛋白顆粒穩定的乳液，說明前者的凝膠性更強，槲皮素起著重要作用。但在復合顆粒穩定的乳液體系中，pH 5.0條件下的G’和G’’值更大，表明乳液的凝膠性更強。如Dai Lei等[28]所述，pH 3.0條件下乳液的G’隨頻率變化表明Pickering乳液凝膠狀結構的形成主要歸因于非共價物理相互作用。而pH 5.0條件下乳液的G’隨頻率變化幅度小則是顆粒凝膠的特征，與Zou Yuan等[10]的觀察結果一致。

圖7D是乳液在應力為0.01%～100%范圍內的動態模量變化。在所有測試樣品中都發現在低應力條件下（γ＜1%），G’大于G’’，且兩者基本不依賴應力的變化。隨著應力進一步增大，G’和G’’都開始下降，當G’下降速度大于G’’時出現交叉點，此點為流動點，說明乳液開始出現流動行為[29]。Zou Yuan等[10]研究發現，應力超過交叉點時，玉米醇溶蛋白/單寧酸復合納米顆粒穩定的乳液表現出以黏性為主導的流動行為。

2.6 乳液的微觀結構

圖8 不同pH值下麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白-槲皮素Pickering乳液的光學顯微鏡（A）和激光共聚焦顯微鏡（B）圖Fig.8 Observation of Pickering emulsions stabilized by G and G-Q particles at different pH values under optical microscope (50 μm) and CLSM (20 μm)

如圖8A所示，pH 3.0條件下，乳液的尺寸較小（～10 μm），乳滴不連續，很少聚集。pH 5.0條件下，乳滴變大（～30 μm），少量聚集，乳液的凝固性開始增強。添加了槲皮素的乳液，觀察到明顯的乳滴聚集現象。然而，盡管有部分聚集現象，但是乳液能夠90 d后保持穩定而不發生油析現象。

為了更好地理解乳液的形成及乳液的穩定性，通過激光共聚焦顯微鏡觀察乳液的微觀結構。如圖8B所示，pH 3.0時，連續相中的紅色蛋白信號較強，而綠色油滴周圍幾乎沒有，表明大量顆粒留在連續相中形成網絡結構，少量顆粒穩定油滴。因此，連續相中蛋白粒子的連續網絡結構對乳液的穩定性起重要作用[14]。

pH 5.0條件下的乳液，油滴附著明顯的蛋白顆粒，且信號強烈突出。油相位于液滴內部，而顆粒在液滴邊界處開始形成緊密堆積結構，有助于乳液的貯藏穩定性，與圖6B、C和圖8A觀察結果一致。pH 5.0條件下，相鄰的油滴挨在一起形成網絡結構穩定了乳液。以上結果說明，pH值不同會使得蛋白粒子的分布具有差異性，也會影響乳滴的聚集狀態[14]。pH 3.0條件下，乳液體系中主要的作用力可能來自于顆粒之間的相互作用（如氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用）；而pH 5.0條件下，吸附在油滴界面的顆粒間的相互作用及油滴之間的相互作用變得更重要。

3 結 論

在不同pH值條件下，探究麥醇溶蛋白與槲皮素的相互作用及其復合物對乳液特性的影響。研究表明，pH值影響蛋白-多酚的相互作用和乳液特性。槲皮素對麥醇溶蛋白有較強的猝滅作用，且疏水相互作用是pH 3.0條件下的主要作用力，范德華力和氫鍵作用是pH 5.0和pH 7.0條件下的主要作用力。不同pH值條件下，乳液的流變學行為及微觀結構方面的差異，可為實際食品體系（如乳制品、調制飲料、蛋黃醬等）的構建提供參考。