L-賴氨酸對雞腿肉肌原纖維蛋白磷酸化的影響

方 芮，朱宗帥，郭秀云，彭增起，張雅瑋

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

蛋白質磷酸化作為一種蛋白質翻譯后的重要修飾方式，已經在醫學、生物化學等領域有廣泛的研究，但在肉品科學領域中研究較少，目前主要集中在蛋白質磷酸化與宰后肉品質的關系方面[1]。已有研究表明，相對較低磷酸化水平的肌原纖維蛋白更容易被鈣蛋白酶降解，從而有利于提高肉的嫩度，改善肉的品質[2-3]，蛋白質磷酸化還可以通過影響與糖酵解有關酶的活性或穩定性，從而影響宰后僵直過程，進一步影響肉的品質[4-6]。此外，蛋白質磷酸化可以負向調控肉色穩定性，主要由于肌紅蛋白發生磷酸化后改變了二級結構的穩定性，導致其氧化速率增加，肉色下降[7-8]。

在肉品加工過程中添加食鹽可以提高肉的保水性、增強產品的質構特性，并賦予產品良好的風味[9]。研究表明，使用質量分數3%食鹽腌制16 h后，能夠顯著降低肌肉的肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平[10]，食鹽腌制可通過抑制堿性磷酸酶和蛋白激酶A活性間接調節肌原纖維蛋白磷酸化水平，從而提高肉嫩度。然而鈉攝入量過高會增加高血壓和心血管疾病等發生的風險[11]，《中國食品工業減鹽指南》指出，我國是食鹽攝入量最高國家之一，有研究報告指出，我國是全球中風發病率最高的國家，而我國的中風發病率高的原因主要與高鈉攝入有關[12]。我國高鹽飲食由來已久，而來源于肉制品的NaCl攝入占人均每日攝入含量的25%[13]，為了國民健康可持續發展，肉制品加工過程的減鹽行動刻不容緩。

前期研究表明，在低鹽條件下（1 mmol/L和0.15 mol/L NaCl）添加5 mmol/LL-賴氨酸（L-Lys）能夠使肌球蛋白分子發生解折疊，蛋白構象發生改變[14]，顯著提高肌球蛋白溶解性；使用含L-Lys的氨基酸型低鈉鹽加工風干咸草魚能夠抑制脂肪氧化程度、減少不良風味物質揮發并降低鈉含量50%以上[15]。在豬肉腸中添加L-Lys也能顯著提高產品的感官評分，賦予良好的色澤[16]。由此可見，L-Lys能夠在降低NaCl用量的同時一定程度上改善肉品品質。本實驗研究在1% NaCl（低鹽）和3% NaCl（高鹽）條件下添加L-Lys對雞腿肉肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響，并明確添加L-Lys在腌制雞腿肉過程中所誘導的磷酸化差異蛋白，旨在為揭示其降低肉中NaCl用量并保持或提高肉品品質的內在原因提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇30 只同一批次的黃羽肉雞（月齡3 個月，2.0～2.2 kg），購自南京半步堂農副產品貿易有限公司，三管齊斷法宰殺后立即剝皮取出腿肉，剔除明顯的結締組織并切割成大小均一的肉樣并混勻，肉樣處理在4 ℃低溫室下進行（宰殺過程和方法符合南京農業大學動物福利的相關規定）。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒 南京建成生物工程研究所；L-Lys 上海瑞永生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑瑞士Roche公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAM）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇（trisamine，Tris） 北京索萊寶生物科技有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）預制膠美國GenScript公司；XT還原劑 美國Bio-Rad公司；20×NuPAGE MES電泳緩沖液、4×NuPAGE LDS樣品緩沖液、Pro-Q Diamond染液、Sypro Ruby染液美國Invitrogen公司；測序級胰蛋白酶 美國Promega公司；Ziptip C18槍頭型脫鹽柱 愛爾蘭Millipore公司；甲酸（formic acid，FA）、乙腈（acetonitrile，ACN）均為國產色譜純；NaCl為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25 digtal Ultra Turrax高速勻漿機 德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍臺式離心機 美國Beckman Coulter公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；M2e多功能酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、PowerPac Basic基礎型電源 美國Bio-Rad公司；SYC-2101水平搖床 美國Crystal公司；Typhoon Trio多功能激光成像系統 美國GE公司；eStain L1蛋白快速染色系統美國GenScript公司；真空濃縮機、nano LC-LTQ-Orbitrap-MS/MS質譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 腌制

將混勻的肉塊（宰后4 ℃成熟90 min）隨機分為15 份，每份稱取30 g肉塊，分別添加質量分數0% NaCl（對照組）、1% NaCl、1% NaCl＋0.06%L-Lys、3% NaCl和3% NaCl＋0.06%L-Lys，拌勻后置于4 ℃腌制16 h。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

樣品制備參照Huang Honggang[5]和Lametsch[17]等的方法并稍作修改。取8.34 g腌制后的肌肉組織加入50 mL預冷的勻漿緩沖液（100 mmol/L Tris，pH 8.3，1 片蛋白酶抑制劑，2 片磷酸酶抑制劑），9 500 r/min冰浴勻漿2×30 s，然后13 500 r/min冰浴勻漿2×30 s。勻漿液15 000 r/min、4 ℃離心20 min，沉淀為肌原纖維蛋白，沉淀溶解于5% SDS溶液（60 ℃）后9 500 r/min勻漿30 s，80 ℃加熱20 min，4 ℃保存備用。使用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，用蒸餾水將各樣品質量濃度調成4 mg/mL。

1.3.3 SDS-PAGE與熒光染色

參照Li Xiao等[6]的方法并稍作修改進行電泳樣品制備。將制備好的電泳樣品進行SDS-PAGE，肌原纖維蛋白上樣量為6 μg，初始電泳電壓為70 V，待條帶跑出濃縮膠后，上調電壓至120 V，電泳結束后取出電泳膠轉入干凈的染色盒中，進行固定液固定過夜12 h，結束后用蒸餾水（3×10 min）徹底洗脫固定液，用Pro-Q Diamond 染液進行避光磷酸化染色1.5 h后，避光脫色1.5 h，結束后用蒸餾水（4×5 min）洗脫，用Typhoon進行熒光拍照，隨后將膠轉入干凈的染色盒中，進行Sypro Ruby染液全蛋白避光染色過夜12 h后，回收染液，避光脫色30 min，結束后用蒸餾水（4×5 min）洗脫，再用Typhoon進行第2次熒光拍照。結束后對電泳膠進行考馬斯亮藍染色，使電泳條帶清晰可見，便于后續的質譜鑒定。整個過程注意防止角蛋白污染，保持膠面干凈無破損。

1.3.4 質譜鑒定

表1 質譜鑒定的流動相組成Table 1Mobile phase composition for LC-MS/MS analysis

肌原纖維蛋白磷酸化水平用Pro-Q Diamond染液染色后的磷酸化條帶光密度值P與Sypro Ruby染液染色后全蛋白條帶光密度值T的比值（P/T）表示，在超凈工作臺上用割膠筆割下P/T值差異顯著的條帶置于1.5 mL離心管中，使用50 μL超純水清洗和50 μL考馬斯亮藍染色脫色液脫色后，加入50 μL ACN脫水直至條帶完全變白，真空抽干后，加10 mmol/L DTT 20 μL，56 ℃水浴1 h；冷卻到室溫后吸干，快速避光加55 mmol/L IAM 20 μL，避光反應45 min。依次用25 mmol/L NH4HCO3（2×10 min）、25 mmol/L NH4HCO3＋50% ACN溶液（2×10 min）、ACN（10 min）洗，ACN脫水到膠粒完全變白為止，真空抽干10 min，37 ℃下用胰蛋白酶進行消化酶解12～16 h，加入0.02% FA終止反應，離心后吸出液相轉至新離心管中，條帶用60% ACN-0.2% FA 100 μL萃取2 次，每次15 min，吸出液相，合并于新離心管中后濃縮揮干，加入30 μL 0.2% FA復溶后用Ziptip C18脫鹽柱進行脫鹽后揮干備用，上機前加入5～10 μL 0.2% FA復溶后全部進入質譜分析。

流動相條件：有機相為ACN，水相添加0.2% FA；流速為0.3 μL/min，不同時間的流動相組成見表1。掃描范圍為m/z300～1 800，電壓40 V，掃描模式按前5 個豐度Scan Event 1～5進行掃描。

1.4 圖像分析與數據處理

使用ImageQuant TL（GE）軟件處理電泳膠拍照后的圖像，對電泳條帶進行光密度值分析后得到相對光密度，使用UniProtKB確定蛋白質種類和功能，所有數據用Microsoft Excel 2016進行分析，使用Origin pro 9.0進行作圖，使用SAS V8進行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan多重比較，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 一維SDS-PAGE與磷酸化水平分析

圖1 雞腿肉肌原纖維蛋白整體磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation levels of myofibrillar proteins from chicken thigh meat

如圖1所示，1% NaCl組和0% NaCl組的磷酸化水平差異不顯著（P＞0.05），3% NaCl組較1% NaCl組和0% NaCl組的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05），此結果與Zhang Caixia等[18]研究一致，而1% NaCl＋0.06%L-Lys組與3% NaCl組相比，在降低NaCl條件下，添加0.06%L-Lys后的肌原纖維整體磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），同時1% NaCl＋0.06%L-Lys組較1% NaCl組能夠顯著降低肌原纖維蛋白整體磷酸化水平（P＜0.05），通過比較可以發現在添加L-Lys時減少鈉鹽還可以達到高鹽條件下的低磷酸化水平。1% NaCl＋0.06%L-Lys組與3% NaCl組之間無顯著差異（P＞0.05），3% NaCl＋0.06%L-Lys與3% NaCl組、1% NaCl＋0.06%L-Lys組之間無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，在低鹽（1% NaCl）條件下，L-Lys的添加所引起的磷酸化水平降低，且與3% NaCl處理組無差異。當肌原纖維蛋白整體磷酸化水平降低時，可能會抑制肌肉收縮，代謝酶的活性也會降低[19]，減緩糖酵解反應，影響宰后僵直過程，提高肉的嫩度并促進肉品質的提高[20]。

圖2 雞腿肉磷酸化肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of phosphorylated myofibrillar proteins from chicken thigh meat

圖3 雞腿肉肌原纖維全蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE patterns of total myofibrillar proteins of chicken thigh meat

從圖2、3可以看出，肌原纖維蛋白條帶電泳結果平直清晰，蛋白分離效果較好，從中選擇16 個條帶，用ImageQuant TL軟件進行相對光密度分析，得到16 個條帶的磷酸化水平結果如表2所示。

表2 添加L-Lys對雞腿肉肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響Table 2 Effect of L-Lys on phosphorylation levels of myofibrillar proteins from chicken thigh meat

注：同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05），n=3。

由表2可以看出，條帶8、9、13、14的3% NaCl組較1% NaCl組和0% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），條帶1、4、8、10、12、15、16的1% NaCl＋0.06%L-Lys組較1% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），條帶5、6、9、12的1% NaCl＋0.06%L-Lys組與3% NaCl組的磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），條帶1、2、3、7、8、10、15、16的1% NaCl＋0.06%L-Lys組較3% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）。同時，條帶4、5、8、10、11、12的3% NaCl＋0.06%L-Lys組較3% NaCl組的磷酸化水平差異不顯著（P＞0.05），條帶1、6、9、13、14、16的3% NaCl＋0.06%L-Lys組較3% NaCl組的磷酸化水平顯著提高（P＜0.05），這可能是由于L-Lys與NaCl之間存在互作關系，對于大部分條帶而言，當NaCl添加量達到3%時，添加0.06%L-Lys并不能繼續顯著降低雞腿肉的肌原纖維蛋白磷酸化水平甚至會提高磷酸化水平。不同處理組的各條帶與肌原纖維蛋白整體磷酸化水平變化并不完全一致，說明NaCl與L-Lys的添加對于單個蛋白磷酸化水平的影響具有差異性。

2.2 磷酸化差異蛋白條帶質譜鑒定

選擇16 條磷酸化差異顯著的條帶進行質譜鑒定，結合UniProtKB數據庫中給出的蛋白信息，篩選出的蛋白結果如表3所示，鑒定出的蛋白主要包括3 類，涉及到肌肉收縮、糖酵解過程以及離子運輸等有關的蛋白。其中出現了肌漿蛋白的主要成分，主要是由于某些糖酵解酶與肌原纖維蛋白中的原肌球蛋白、肌動蛋白等有很強的結合力，同時，在離心結束后，也會存在一些肌漿蛋白質溶于肌原纖維蛋白沉淀中，難以完全去除[21]。

表3 雞腿肉肌原纖維蛋白質譜鑒定結果Table 3Identification of myofibrillar proteins in chicken thigh meat by LCMS/MS

注：—.未鑒定。

肌原纖維蛋白質譜鑒定結果表明，1、7、8這3 個條帶為未鑒定蛋白，條帶2主要是肌球蛋白重鏈，肌球蛋白重鏈主要與肌肉收縮等肌節功能有關。肌球蛋白重鏈的磷酸化通常與輕鏈磷酸化相互介導，而在一定的生理狀態下，肌球蛋白重鏈發生去磷酸化時，促使肌動球蛋白解離，肌動球蛋白ATPase活性顯著降低，最終導致肉品嫩度和保水性下降[22-24]。表2結果顯示，添加NaCl后，肌球蛋白重鏈磷酸化水平均顯著提高（P＜0.05），而1% NaCl＋0.06%L-Lys組、3% NaCl＋0.06%L-Lys組的肌球蛋白重鏈較3% NaCl組的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），相對較低的磷酸化水平會抑制肌球蛋白的降解。條帶3主要是M蛋白，它是橫紋肌中肌原纖維M帶的結構成分，主要與肌動蛋白絲結合，與肌肉收縮有關，可能在肌源纖維結構的維穩中發揮重要作用[25]。而當M蛋白發生磷酸化時，與肌球蛋白的結合力減弱[26]，將加快蛋白降解。添加NaCl后，M蛋白磷酸化水平顯著提高（P＜0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys組的M蛋白較1% NaCl組的磷酸化水平顯著提高（P＜0.05），3%NaCl＋0.06%L-Lys組的M蛋白較3% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），說明低鹽條件下添加0.06%L-Lys能夠加快蛋白降解，改善肉嫩度，而高鹽條件下添加0.06%L-Lys不利于蛋白降解，不利于肉品質。

條帶4、11分別為α-輔肌動蛋白-2和肌動蛋白，α-輔肌動蛋白-2存在于肌肉組織中，它可以維持肌原纖維結構的穩定性，與肌肉收縮有關，交聯肌動蛋白并參與信號轉導過程，進而影響肌動蛋白絲的形成[27]。當α-輔肌動蛋白-2發生磷酸化時，會促進肌肉收縮并不利于肌原纖維結構維穩[28]，1% NaCl ＋0.06%L-Lys組的α-輔肌動蛋白-2磷酸化水平較3% NaCl組顯著提高（P＜0.05），3% NaCl＋0.06%L-Lys組較3% NaCl組的α-輔肌動蛋白-2磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），說明低鹽條件下添加0.06%L-Lys有利于肌原纖維結構維穩。肌動蛋白是一種高度保守的蛋白質，其參與各種類型的細胞運動并且在所有真核細胞中普遍表達。1% NaCl＋0.06%L-Lys組的肌動蛋白磷酸化水平較1% NaCl組、3% NaCl組均顯著提高（P＜0.05），而當肌動蛋白磷酸化程度升高時，不易被鈣蛋白酶降解，同時保水性也會降低[29-30]。

條帶5、13為肌漿/內質網鈣ATP酶1和電壓依賴性陰離子通道。肌漿/內質網鈣ATP酶1是一種主要的Ca2＋轉運酶，負責將細胞溶質中的Ca2＋重新轉運到內質網并催化ATP的水解，它有助于肌肉激發或收縮過程中涉及的鈣螯合[31]。各處理組的肌漿/內質網鈣ATP酶1磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），當它發生磷酸化時，催化ATP水解的活性下降[32]。電壓依賴性陰離子通道是位于線粒體外膜上的孔狀蛋白，也是控制陰離子進出線粒體的重要通道，3% NaCl＋0.06%L-Lys組的電壓依賴性陰離子通道磷酸化水平較其他處理組顯著提高（P＜0.05），當它發生磷酸化時，能夠干擾ADP的運輸和ATP生物合成[33]。

已有研究發現，當糖酵解相關的酶發生磷酸化時，會影響酶的活性，如6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶發生磷酸化時，酶活性提高，促進糖酵解過程，影響肉的pH值變化進而影響肉的僵直過程，不利于提高肉品質[34]。條帶6、9、10主要為6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、β-烯醇化酶等參與糖酵解過程的酶，1% NaCl＋0.06%L-Lys組的丙酮酸激酶與3% NaCl組的低磷酸化水平差異不顯著（P＞0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys組的β-烯醇化酶較1% NaCl組和3% NaCl組的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），表明低鹽條件下添加0.06%L-Lys可以通過降低部分糖酵解酶的磷酸化水平達到提高肉品質的目的。

條帶12、14、15和16主要是原肌球蛋白α-1鏈、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈3。原肌球蛋白α-1鏈是一種細肌絲相關蛋白，當它發生磷酸化時，有助于調節應激纖維的形成[35]，促進細胞骨架的重構[36]，肌球蛋白是細胞骨架的主要成分，當肌球蛋白輕鏈發生磷酸化時，會影響加快骨骼肌收縮頻率[37]，誘導平滑肌收縮，影響細胞的主要活動等生理過程[38-39]，且肌球蛋白輕鏈2磷酸化的程度與肌肉收縮力增強程度呈正比[40]，相對較低的磷酸化水平更容易被鈣蛋白酶降解，有利于肉品嫩度的提高。1% NaCl＋0.06%L-Lys組的原肌球蛋白α-1鏈、肌球蛋白輕鏈2、肌球蛋白輕鏈3較1% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys組的肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈3較3% NaCl組的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），說明低鹽條件下添加0.06%L-Lys可以促進蛋白降解。

3 結 論

在1% NaCl條件下添加0.06%L-Lys降低雞腿肉肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平，并與3% NaCl的整體磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05）。在3% NaCl處理組中添加0.06%L-Lys較3% NaCl組的整體磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），并顯著提高了6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈3的磷酸化水平（P＜0.05），表明0.06%L-Lys的添加并不隨著NaCl用量的提高而顯著影響蛋白的磷酸化水平（P＞0.05）。與3% NaCl組相比，0.06%L-Lys在1% NaCl條件下顯著降低肌球蛋白重鏈、β-烯醇化酶、肌球蛋白輕鏈2、肌球蛋白輕鏈3磷酸化水平（P＜0.05）。L-Lys的添加有可能通過對肌原纖維蛋白磷酸化水平產生的正面效應，進而促進鈣蛋白酶對蛋白的降解，影響肌肉收縮和宰后僵直成熟過程，為降低肉品中NaCl用量的同時正向調控肉品質提供理論基礎。