PLA/PGA復合納米纖維膜的制備及其生物相容性與降解性研究

王詩卉，李 光，金俊弘，楊勝林

(東華大學 材料科學與工程學院 纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620)

疝氣是普外科的一種常見病和多發病[1]，其傳統的治療方法是對薄弱組織進行縫合、加固軟組織，但術后復發率高，目前較好的方式是使用醫療補片修補軟組織薄弱部位，降低了復發率和手術疼痛感，傷口小，恢復快[2]。此外，據統計7%的女性會出現盆底功能障礙—盆底脫垂，并需要治療以緩解癥狀，其中在5年內需要重復治療的患者占13%[3]。目前，治療女性盆底功能障礙性疾病的先進手段是在體內植入補片以起到支撐修復重建盆底功能的效果，相比傳統切除的方式，植入補片治療可以提高手術安全性，改善術后患者的生活質量[4]。無張力疝氣修補術和盆底重建的關鍵均在于選擇合適的補片材料，要求補片材料既具有足夠的力學性能以達到修補效果，又具有可降解、生物友好特性以減少受體排異反應。

目前應用最廣泛的醫用補片材料是聚丙烯[5]。聚丙烯補片的特點是具有較好的強度以及彈性，但是作為一種不可吸收的材料，植入體內后，會引起較強的炎癥反應[6]。因此，可吸收補片及其材料成為人們研究的熱點。聚乳酸(PLA)及聚羥基乙酸(PGA)均是生物友好可降解材料，其在體內最終降解產物是水和二氧化碳，在醫學上已得到廣泛應用，是目前發展前景較好的生物醫用材料。其中，PLA力學性能良好，但其降解速度較慢，降解產物二氧化碳會使組織周圍酸性增加引起組織非炎癥反應，且易析出小PLA結晶影響細胞生長的活性和增殖[7]。PGA與PLA相比降解速度快、生物相容性好，在體內應用時有利于細胞增殖以及細胞粘附[8]，但其力學性能衰減較快。20世紀90年代初，研究人員開發了由丙交酯(LA)和乙交酯(GA)開環聚合得到的高相對分子質量PLA和PGA，但由于其對水和熱的敏感性而未能引起廣泛重視。A.M.REED等[9]將GA和LA共聚，發現通過改變GA和LA的比例，可以有效調節共聚物的降解速率。對于生物可降解材料，材料的降解速度是否與應用所需時間匹配是一個重要因素。PGA、PLA及其共聚物(PLGA)(乙交酯-丙交酯按不同比例共聚所得的聚合物)目前較常用于組織工程和支架材料。PGA和PLA具有各自的優缺點，將其復合(共聚或共混)使用，可以根據不同的復合比例來調節材料的降解速率和力學性能，獲得降解速度與組織修復速度相一致的材料，并且不會由于降解而失去所需強度，作為補片用于治療時可以修復組織，且逐漸降解，最終完成生物意義上的修復。

OUYANG H W等[10]使用PLGA制作肌腱支架，以人骨髓間充質干細胞(BMSC)為接種細胞植入兔子體內，12周后檢測，PLGA支架拉伸剛度可達正常功能的87%，說明PLGA作為生物材料使用，可滿足材料所需力學性能且生物相容性良好。寇士軍等[11]將PLA、PGA熔融紡絲，得到一種新型芯鞘復合纖維，并對其降解性能進行研究，結果顯示，復合纖維的水解率隨著PGA含量的增加而增加，證明了可通過調整PLA與PGA的復合比例來控制復合纖維的降解速率的可行性。戰鶴楠等[12]將聚己內酯(PCL)與γ-聚谷氨酸(γ-PGA)混合，利用靜電紡絲制得復合纖維膜，成膜性良好，且纖維的形貌均一，作為補片材料使用時形貌良好。

綜上所述，合理匹配利用PLA良好的力學性能和PGA良好的生物相容性能，制備的PLA/PGA復合材料可單獨使用或作為輔材，有望在醫用補片開發方面獲得利用。作者利用靜電紡絲技術，通過調整PLA與PGA的復合比例，制得5種PLA/PGA復合納米纖維膜，考察了PLA與PGA的不同質量比對復合納米纖維膜的降解行為及生物相容性的影響。

1 實驗

1.1 主要試劑和儀器

PLA、PGA：纖維級粒料，東華大學纖維改性國家重點實驗室提供；六氟異丙醇：光譜純，上海德默醫藥科技有限公司產；磷酸鹽緩沖液：上海易勢化工有限公司產；磷酸二氫鉀(KH2PO4)、一水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·H2O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)：均為分析純，國藥集團提供。

靜電紡絲設備：實驗室自制； FD-1A-50型冷凍干燥機：北京博醫康儀器有限公司制； DSC 822型差示掃描量熱儀：瑞士梅特利-托利多公司制； S-4800型掃描電子顯微鏡：日本HITACHI公司制； Instron 5969型電子萬能試驗機：美國Instron公司制。

1.2 PLA/PGA復合納米纖維膜的制備

將PLA、PGA以不同質量比混合并投入六氟異丙醇中，在50 ℃下磁力攪拌直至粒料全部溶解，得到PLA與PGA總質量分數為10%的微黃色透明的靜電紡絲溶液。在25 ℃和相對濕度30%的環境下，將得到的靜電紡絲溶液轉入塑料注射器制成的噴絲管中，設置電源電壓18 kV、注射泵推進速度15 μL/min，采用直徑為1.2 mm的噴絲頭進行靜電紡絲，以接地平面屏接收，接收距離為15 cm。收集到的試樣用去離子水洗凈并用濾紙吸去表面水分，再用冷凍干燥機于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，得到PLA/PGA納米纖維膜。其中，PLA與PGA質量比為100:0，90:10，80:20，70:30，60:40的PLA/PGA納米纖維膜試樣分別標記為0#，1#，2#，3#，4#。另外，純PGA無法紡絲，將PGA粉末標記為5#試樣。

1.3 PLA/PGA納米纖維膜的體外降解實驗

降解液的配制：使用磷酸鹽緩沖液模擬人體內降解環境，依次稱取8.0 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.56 g Na2HPO4·H2O、0.2 g KCl，溶解于磷酸鹽緩沖液中，充分攪拌后，定容為1 000 mL的降解液，以備使用。

體外降解實驗：將不同復合比的PLA/PGA納米纖維膜裁剪成50 mm×50 mm(用于降解質量損失測試)及50 mm×10 mm(用于力學性能測試)規格的樣條，置于圓形玻璃培養皿中，加入配置好的降解液浸沒樣條，然后一并放入培養箱中于37 ℃下靜置，每隔1 d更換降解液并保持樣條浸沒狀態。每隔5 d進行取樣，取樣后用去離子水清洗并用濾紙吸去表面水分，再在冷凍干燥機內于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，分別得到浸沒5，10，20，30 d的降解試樣。

1.4 分析與測試

熱性能：稱取PLA/PGA納米纖維膜試樣5～10 mg置于鋁坩堝中進行差示掃描量熱(DSC)測試。將試樣先升溫至250 ℃并保溫3 min去除熱歷史，冷卻到室溫后再以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，記錄二次升溫的熱流。

表面形態：將PLA/PGA納米纖維膜試樣經濺射鍍金處理后，采用掃描電鏡(SEM)觀察其表面形態。

細胞毒性：將PLA/PGA納米纖維膜裁剪成100 mm×100 mm的大小嚴格滅菌后置于干凈的玻璃培養皿中，加入20 mL高糖培養基，置于二氧化碳細胞培養箱(溫度37 ℃，通入CO2體積分數0.5%)中放置72 h得到材料浸漬液。用所制得的材料浸漬液培養小鼠成纖維細胞(L929細胞)，培養時間分別為24，48，72 h，并以cck-8試劑法分別評價其細胞毒性。

細胞黏附形態：將PLA/PGA納米纖維膜裁剪成合適的大小放置于12孔培養皿中，使用滅菌鋼環壓住，種入L929細胞，培養72 h后對細胞進行固定脫水，鍍金處理后使用SEM觀察納米纖維膜上細胞黏附形態。

體外降解性能：根據體外降解前后PLA/PGA納米纖維膜試樣的質量，計算質量損失率，來表征納米纖維膜的降解性能。

力學性能：使用電子萬能試驗機對降解試樣進行拉伸實驗，測試纖維膜的拉伸強度。試樣夾持長度為5 cm，拉伸速率為10 mm/min。

2 結果與討論

2.1 PLA/PGA納米纖維膜熱性能及表面形貌

PLA/PGA納米纖維膜去除熱歷史后的DSC曲線見圖1，相關結晶特征數據如熔點(Tm)和熔融熱焓(?Hm)列于表1。從圖1和表1可以看出：納米纖維膜中PLA和PGA相互影響導致各自的熱性能發生明顯變化；PGA開始結晶時，熔點較低的PLA仍呈熔體狀態并對PGA的結晶造成阻礙，使PLA/PGA納米纖維膜的?Hm降低且Tm出現雙峰，其中高溫峰值與純PGA的Tm相比變化不大，這是共混物中PGA富集區形成的完善程度高的結晶的貢獻，而PGA富集程度低的區域中其分子運動受到PLA的影響、結晶完善程度降低，從而出現溫度相對較低的熔融峰，且峰值隨PLA含量增加而降低；而PLA開始結晶時，PGA已完成結晶且晶粒會成為成核劑促進PLA的結晶，因此與純PLA相比共混膜中PLA的?Hm增大、Tm增高，但PGA含量增加、晶核數量增多時誘導生成的PLA晶粒也多，晶粒如同物理交聯點又會使PGA的活動能力受限，故PLA的?Hm增大的程度會隨PGA含量增加而減弱，這也是4#試樣的Tm又降下來的原因。二者的結晶特性能互相影響的原因，是類似于同系物的PLA和PGA相容性良好、二者大分子之間相互分散程度高所致。

由此可見，PLA與PGA相容性良好，這將有利于獲得力學性能良好的納米纖維膜并發揮二者的協同作用。

圖1 PLA/PGA納米纖維膜的DSC曲線Fig.1 DSC patterns of PLA/PGA nanofiber membrane

表1 PLA/PGA納米纖維膜的DSC數據Tab.1 DSC data of PLA/PGA nanofiber membrane

除了純PGA因結晶度高難以溶解完全而未能進行靜電紡絲外，其他組成的靜電紡絲溶液盡管黏度隨PGA含量增加而有所增大，但均能順利地經靜電紡絲制得形貌良好的納米纖維膜。從圖2可知，5種不同復合比例的PLA/PGA納米纖維膜的纖維粗細均勻，表面光滑，無明顯差異，PGA含量最高的4#試樣的纖維形貌也是表面平整、光滑，無串珠的形成，無明顯纖維間粘連現象。這說明在本實驗選擇的復合比例和濃度范圍內，PLA/PGA溶液具有良好的靜電紡絲性能。

圖2 PLA/PGA納米纖維膜表面的SEM照片Fig.2 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane

2.2 PLA/PGA納米纖維膜的生物相容性

cck-8試劑所含有的WST-8在電子載體的作用下可被細胞線粒體中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲臜產物，生成數與活細胞數量成正比，因此，用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其吸光度(O.D.值)，可間接反映活細胞數量。采用cck-8法對不同PLA/PGA復合比例的5種納米纖維膜對L929細胞的增殖率進行評價，同時設置空白樣對照，測試結果見表2。

表2 不同培養時間下PLA/PGA納米纖維膜的O.D.值Tab.2 O.D.value of PLA/PGA nanofiber membrane at different culture time

從表2可以看出：隨著培養時間的增加，空白樣與測試樣的O.D.值均增大，表明5種納米纖維膜均未表現出細胞毒性且有利于細胞增殖；隨著PGA含量的增加，測試樣的O.D.值也不斷增大，培養72 h后，4#試樣的O.D.值明顯大于0#試樣(純PLA纖維膜)，這與PGA的生物相容性優于PLA相符合。

細胞可以較好地在材料表面生長并且伸展，則表明材料具有更好的生物相容性。圖3為L929細胞接種于5種納米纖維膜表面72 h后的SEM照片，觀察所拍攝的細胞照片可以發現L929細胞在纖維表面能夠良好的生長、粘附在纖維上，細胞在纖維表面伸展，生長形態良好；相比0#試樣，4#試樣表面細胞表現出更為伸展的形貌，并且細胞與纖維的粘合程度更深(生長在納米纖維膜內)。這表明隨著PGA含量的增加，細胞在納米纖維膜表面生長粘附形貌更好，細胞增殖數也增高，PLA/PGA納米纖維膜相比純PLA纖維膜表現出更好的生物相容性。

圖3 PLA/PGA納米纖維膜表面的細胞黏附形態Fig.3 Morphology of cell adhesion on the surface of PLA/PGA nanofiber membrane

2.3 PLA/PGA納米纖維膜的體外降解性能

從圖4可以看出，相比未降解的PLA/PGA納米纖維膜(圖2)，不同復合比例的納米纖維膜在體外降解30 d后，纖維膜表面光潔度下降，表面附著降解后的小顆粒，損傷增加，出現了細紋，纖維粗細均勻度也下降，并且隨著PGA含量的提高，納米纖維膜表面細紋增多，纖維表面粗糙度增加。纖維表面形態的變化大說明PLA/PGA納米纖維膜的降解速率大，這與PGA的降解速率大于PLA相一致。

圖4 體外降解30 d后PLA/PGA納米纖維膜表面的SEM照片Fig.4 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane after 30 days of degradation in vitro

PLA/PGA納米纖維膜在體外降解的質量損失情況如圖5所示。從圖5可以看出：在30 d的體外降解過程中，純PLA納米纖維膜(0#試樣)因PLA本身的降解較慢，體外降解的質量損失最小，體外降解30 d后質量損失只有5.4%，其降解速率也相對恒定；1#～4#PLA/PGA納米纖維膜在體外降解初期(5 d內)，其降解速率快、質量損失大，質量損失的趨勢隨PGA含量的增加而更加明顯，1#試樣質量損失率為3.36%，4#試樣的質量損失率達5.93%，這是由PGA的快速降解特性所決定；但是，在體外降解后期，1#～4#PLA/PGA納米纖維膜的降解速率明顯低于純PLA納米纖維膜，并且從總體上看PGA含量越高，降解速率越慢，這是由于PGA的存在使PLA的結晶程度提高、無定形區含量降低造成的，因為水分子是首先進入結構疏松的無定形區使酯鍵斷裂而引起降解。

圖5 PLA/PGA納米纖維膜體外降解的質量損失率隨降解時間的變化Fig.5 Change of mass loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#試樣；●—1#試樣；▲—2#試樣；▼—3#試樣；◆—4#試樣

由于PLA的相對分子質量遠高于PGA，故PLA/PGA復合納米纖維膜的力學性能主要取決于PLA。從圖6a可以看出，加入PGA后，PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度均低于純PLA納米纖維膜，且隨著降解的進行，PLA、PGA在水分子的作用下分子鏈逐漸裂解，纖維膜的拉伸強度隨降解時間的增加持續降低。但進一步考察納米纖維膜在降解過程中的強度損失率(見圖6b)，從總體上看，在不同的PGA添加量下，PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度損失率要低于純PLA納米纖維膜。在降解初期(5 d內)，盡管PLA/PGA納米纖維膜的降解速率快，但其貢獻主要是PGA提供，僅PGA含量最高的4#試樣的拉伸強度損失率為24.4%，略高于純PLA納米纖維膜的14.7%，其他PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度損失率仍低于純PLA納米纖維膜；隨著降解時間的延長，PLA/PGA納米纖維膜的降解速率更低，降解30 d后，4#試樣的拉伸強度損失率為51.7%，也低于0#試樣的60.0%。因此，在PLA中引入PGA，一方面可以調整PLA的降解速率以利于制件在有效時間內維持必要的力學性能，另一方面可以利用PGA本身的快速降解來保證總體的降解量，提供良好的生物相容性。

圖6 PLA/PGA納米纖維膜體外降解過程中拉伸強度及其損失率隨降解時間的變化Fig.6 Change of tensile strength and its loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#試樣；●—1#試樣；▲—2#試樣；▼—3#試樣；◆—4#試樣

3 結論

a. 通過靜電紡絲制備5種不同復合比例的PLA/PGA納米纖維膜，并對纖維膜進行體外降解實驗。合理選擇PLA與PGA的共混比例，可以調控纖維膜的降解行為，獲得生物相容性和力學性能優良的纖維膜。

b. PLA與PGA的相容性良好，有利于發揮PLA良好的力學性能。

c. PLA/PGA復合納米纖維膜均不具有毒性，且隨著PGA含量的提高，纖維膜表現出更好的生物相容性，細胞生長、黏附形態更好。

d. PGA的引入提高了PLA的結晶程度，隨PGA含量的提高，PLA/PGA復合納米纖維膜的質量損失率更高，但拉伸強度損失率反而更低。