狐源大腸桿菌中氯霉素類抗生素耐藥基因的檢測

馮 濤 富景寧 薛 原*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.隆化縣農業農村局，承德，068150)

大腸桿菌(Escherichiacoli)廣泛存在于人和動物的腸道內，在人畜共患的細菌中十分常見，可以通過糞便造成環境的細菌污染，大腸桿菌通過質粒使其廣泛傳播，對人類和動物的健康具有潛在的威脅[1]。近幾年，狐(Vulpesspp.)的飼養十分普遍，具有較高的經濟價值和較大的養殖前景。

氯霉素類藥物在臨床上較為常用的有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，這類藥物的抗菌譜廣，在體內的分布也很廣泛，對大腸桿菌的抑菌效果明顯，在獸醫的臨床用藥中占有不可或缺的地位[2]。但是，隨著對氯霉素類藥物的研究越來越深入，其毒性大，易產生耐藥性，并且殘留于動物機體內抑制某些蛋白質合成等缺點也逐漸暴露出來，包括中國在內的世界上很多的國家都已經禁止氯霉素和甲砜霉素在獸醫臨床上的使用[3]。氟苯尼考作為氯霉素的衍生藥物，其在一定程度上具有較強的安全性和有效性，其在我國仍然被用作為獸藥和添加劑而廣泛使用[4]。由于臨床使用存在問題，氟苯尼考的耐藥性也在逐年上升，對環境造成一定的選擇壓力。氯霉素類耐藥基因中cmlA、cat和floR的研究比較廣泛，其中cmlA基因主要依賴外排泵機制使細菌產生耐藥性[5]，cat基因與氯霉素乙酰轉移酶的滅活有關[6]，而氟苯尼考的耐藥機制的研究主要集中在floR基因上[7]。

本試驗檢測和分析了東北地區不同狐源養殖場中氯霉素類耐藥基因分布情況，根據對氯霉素類耐藥性的研究發現，狐源大腸桿菌對氯霉素的耐藥率高達67.41%，對氟苯尼考的耐藥性也達到了46.43%，因此調查狐源中耐氯霉素類大腸桿菌的分子流行情況，旨在掌握耐藥基因的分布情況和流行規律，從而控制耐藥性的進一步傳播，為氯霉素類藥物的合理使用提供理論依據，并對東北地區狐源養殖場的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌質控菌株(菌株編號為ATCC25922)，由中國獸醫藥品監察所提供；試驗菌株于2016—2019年分離自東北不同地區狐養殖場，并分離純化和鑒定的大腸桿菌224株。

1.2 試劑

10×Buffer、Dntp、Taq酶、DL-2000 Marker、6×Loading Buffer、pMD18-T載體，感受態細胞E.coliDH5α，均由TaKaRa公司提供；質粒小量提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒，均由愛思進生物技術有限責任公司提供。

1.3 耐藥基因的檢測

PCR擴增的模板為已鑒定的大腸桿菌的質粒和菌液，采用25 μL PCR擴增體系，按照參考文獻[8-9]設計引物序列(表1)。PCR擴增體系為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min，退火溫度見表1。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，隨機選擇各個基因的陽性樣本進行膠回收，連接到18-T載體上，進行克隆測序后將質粒樣本送至吉林庫美生物技術有限公司，利用DNASTAR軟件分析，與NCBI的數據庫進行同源性比較分析。

表1 耐藥基因的引物序列

2 結果與分析

2.1 耐藥基因檢測結果

在224株狐源大腸桿菌中，結果表明cmlA、cat和floR基因擴增均出現陽性，有77.23%的大腸桿菌可以攜帶氯霉素類耐藥基因，擴增片段大小與預期目的片段相符，經測序可得，其同源性均在99%以上(圖1，圖2，圖3)。cmlA基因擴增的陽性例數為73例，陽性率為32.59%；cat基因檢出的陽性樣本有98例，檢出率為43.75%；floR基因中有79例樣本被檢出，陽性率為35.27%(表2)。分別計算攜帶單個基因以及多個基因的情況，結果表明在224株狐源大腸桿菌中，只單獨攜帶1種基因的比例占大多數，為47.32%，存在攜帶2個及3個以上基因的大腸桿菌。

圖1 部分cmlA基因PCR產物的電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of portion cmlA 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對照；2—9：部分cmlA基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-9，PCR products of cmlA gene

圖2 部分cat基因PCR產物的電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of portion cat 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對照；2—10：部分cat基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-10，PCR products of cat gene

圖3 部分floR基因PCR產物的電泳圖譜Fig.3 The electrophoretogram of portion floR 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對照；2—7：部分floR基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-7，PCR products of floR gene

2.2 耐藥基因分布情況

不同地區的分布情況見圖4，不同基因在東北不同地區的分布存在差異，各個基因在這3個地區均有檢出，其中cmlA和cat基因在各地區的存在較為普遍，并保持較為相似的水平；floR基因的差異十分明顯，以遼寧地區的檢出率最高。

表2 狐源大腸桿菌產氯霉素類耐藥基因攜帶情況及基因型

圖4 氯霉素類耐藥基因的地區分布Fig.4 The distribution of chloramphenicol resistant gene

3 討論

隨著細菌對抗生素的耐藥性逐漸升高，多重耐藥菌對環境的污染越來越嚴重，導致在臨床治療上的影響也趨于復雜化，一些日常的疾病也發生治療失敗的情況[10]。抗生素的使用壓力加大，在分子水平上，耐藥基因可以通過水平傳播和垂直傳播擴散到不同的個體、種群和環境中，抗生素的使用不當促進了耐藥基因的產生和傳播。尤其是動物的耐藥性和耐藥基因可以通過食物鏈傳播到人類中，為人類疾病的治療同樣產生了威脅[11]。

在初期的研究中發現，氯霉素類的耐藥性表現出一種較高的水平[12]，因此本試驗對狐源大腸桿菌進行氯霉素類耐藥基因的檢測和分析。cmlA基因是通過對外排泵上的蛋白來發揮作用，該蛋白可以保護機體免受氯霉素的影響，還可以改變藥物的通路，使細菌產生對氯霉素的耐藥性[5]。cat基因表達氯霉素乙酰轉移酶從而產生滅活作用，細菌產生耐藥性[6]。有173株可攜帶氯霉素類耐藥基因，檢出率高達77.23%。其中cat基因的陽性率較高，共有43.75%的大腸桿菌攜帶該耐藥基因，這個結果與趙鳳菊等[13]對豬源大腸桿菌氯霉素耐藥基因的檢測結果相似；cmlA的檢出率為32.59%，與Momtaz等[14]對伊朗地區雞源大腸桿菌的檢測結果類似。這兩種基因都對氯霉素產生作用，從而使機體產生耐藥性。氯霉素雖然在獸藥中被禁用了較長的時間，但是其耐藥性和耐藥基因的攜帶率仍然存在，可能與氯霉素易殘留并且較難降解的特點有關，雖然該類藥物已經不再使用，但是環境中存在的污染和繁殖過程中的傳播仍然存在，還需要時間來消除它的影響。根據之前對虎源大腸桿菌的研究[3]，cmlA和cat基因的檢出率已經有所下降。氟苯尼考的耐藥性為46.43%，其耐藥基因floR存在于質粒中[15]，并伴隨質粒進行傳播，從而使氟苯尼考的耐藥性也在逐年上升。本試驗中floR基因的陽性率為35.27%，這個結果與劉艷紅等[16]對豬源和雞源的大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的研究結果相差較多，這個差異可能跟物種不同有關，在東北地區狐的飼養用藥中，對氟苯尼考的使用還較少，但是其耐藥性的增長仍然需要關注。只單獨攜帶一種基因的比例占大多數，這個結果表明這3種基因相互之前的影響較小。比較分析不同地區耐藥基因的分布情況，不同地區較為優勢的基因不同，cmlA和cat基因在各地區都保持較為相似的水平，均表現為50%左右，沒有較大的差異起伏；floR基因的地區差異尤為明顯，以遼寧地區的檢出率最高，表明該基因具有快速擴散和傳播的潛力，需要加強監控。

狐的飼養具有較為廣泛的發展前景，開展氯霉素類耐藥基因的檢測和監控，掌握產生氯霉素類藥物耐藥的主要機制，可以防止多重耐藥菌的擴散和爆發，降低對狐的經濟價值的影響，對指導養殖場臨床用藥具有一定的意義。了解耐藥基因的流行病學規律，可以有效地降低耐藥性及其相應的基因從動物擴散到環境甚至傳播到人類的風險。因此，建議加強合理使用抗生素的管理，減少對抗生素產生環境壓力，避免甚至消除耐藥性的傳播和擴散，為新藥的研制提供分子基礎。