高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物組及常見抗生素抗性基因的比較

馮天舒 俞巧玲 周 蕊 王逸潔 蘇軍虎 李 歡，3*

(1.蘭州大學公共衛生學院，蘭州，730000；2.甘肅農業大學草業學院，蘭州，730070；3.蘭州大學草地微生物研究中心，蘭州，730000)

哺乳動物的胃腸道定植有數百種有益于健康的微生物[1]。通常這些動物的腸道在出生時是無菌的，但很快就會從母體、飲食、周圍環境和其他個體中獲得微生物[2]。腸道微生物群大約由數百到數千種微生物組成[3]，并具有多種功能，包括多糖的消化，纖維素的分解，能量的平衡以及免疫調節等功能[1，4-5]。鑒于腸道菌群對動物健康的重要作用，它被認為是哺乳動物的一個新“器官”[6-7]。除了以上功能，腸道菌群在動物的適應性進化過程中也發揮了重要作用。比如，青藏高原哺乳動物腸道微生物組進化出了很強的食物利用能力和纖維素降解活性，并且能夠產生更多的短鏈脂肪酸[8]，而短鏈脂肪酸是纖維素等多糖類物質經哺乳動物腸道微生物發酵產生的主要代謝產物，在宿主對營養物質的利用、免疫調節、脂質代謝和糖異生等生理功能中起著關鍵作用[9]。腸道微生物在具備眾多功能的同時，也受到諸多因素的影響，比如膳食、環境以及宿主的種類均能影響哺乳動物腸道菌群的組成[10-11]，而腸道菌群組成的改變可以導致其功能發生變化[12]，繼而可能影響動物的生理和適應性。生活在青藏高原的野生動物的腸道微生物一樣會受到這些因素的影響。

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和高原鼢鼠(Eospalaxfontanieriibaileyi)均是青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)高寒草甸(alpine meadow)生態系統中重要的物種，在高寒草甸物質流動和能量循環中發揮著重要作用[13-14]，但它們的食性和棲息環境存在差異。高原鼠兔屬于哺乳綱(Mammalia)，兔形目(Lagomorpha)，鼠兔科(Ochotonidae)，鼠兔屬；它們在洞穴中生活；是植食性動物，喜食地面上的植物，以植物葉、莖、花、根、芽為食，較少攝入種子和粗老纖維化或含水量少的器官或組織，主要以禾本科(Gramineae)和豆科(Leguminosae)植物為食[15]。由于它與牲畜爭奪青草，進而導致牧場退化，因而一直被認為是有害的物種[16]。然而，一些生態學家指出，高原鼠兔有助于加速土壤氮循環，對生態系統作出了積極貢獻；因此，高原鼠兔被列為青藏高原重點物種并被譽為生態系統工程師[17]。高原鼢鼠屬于嚙齒目(Rodentia)，倉鼠科(Cricetidae)，鼢鼠亞科(Myospalacinae)，鼢鼠屬；它們通常在地下生活；也屬于植食性動物，但通常以植物根、皮、莖、葉、果實和種子為食，喜食伴生雜草，對禾本科和莎草科(Cyperaceae)攝入較少。高原鼢鼠和高原鼠兔生態功能相似，并被認為是高寒草甸土壤運動的重要媒介[18-19]。由于青藏高原平均海拔在4 000 m以上，是地球上最高的高原，食物匱乏，具有獨特的缺氧、寒冷、強紫外線等惡劣氣候和地理環境[20-21]。這一系列的環境壓力會導致動物生理活動的改變，進而可能會影響高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物的組成和功能。

作為20世紀最重要的醫學發現之一，抗生素(antibiotic)在控制感染性方面發揮了重要作用，然而，由于近年來抗生素的濫用，導致了一大批耐藥性致病菌的出現。有研究表明僅有少量的抗生素被有效利用，大部分抗生素及其在動物體內誘導出的抗生素抗性基因隨著動物的尿液和糞便直接排出體外。抗生素抗性基因在環境中持續存在以及在不同介質中傳播往往引起比抗生素本身更大的危害[22-23]，抗生素的濫用增加了人和動物微生物群中耐藥基因的流行率[24]。近年來，抗生素耐藥已成為全球主要的公共衛生問題[25]。抗生素耐藥基因的歷史可分為“抗生素前”時期和“抗生素”時期，前者抗生素耐藥性的獲得主要通過復制和突變，是一個長期的過程；而后者則是一個短暫的過程，大規模生產并使用抗生素在各生態系統中對細菌施加了強大的選擇性壓力[26]。宿主可以通過水平基因轉移從其他細菌獲得抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)，也可由自身產生[26]。有證據說明腸道細菌可以相互交換耐藥基因，還可以通過與結腸的細菌相互作用獲得并傳播抗生素耐藥基因[27]。因而，在哺乳動物生命活動中發揮著重要作用的腸道微生物也有可能通過貯存和傳播抗生素耐藥基因對健康產生危害。例如，土霉素(oxytetracycline)屬于四環素(tetracycline)類，有研究發現，蜜蜂(Maryland bees)長期接觸這種抗生素后，在其腸道微生物群中發現了四環素抗性基因[28]。目前，有基于培養和亞基因組的研究證實了在人類微生物中存在一個抗生素耐藥性的基因庫，在對人類微生物群的研究中發現在腸道微生物中攜帶一些抗藥性基因，如ermG、ermB、ermF、tetM、tetQ和vanB[27，29]。盡管高原鼢鼠和高原鼠兔是野生動物，它們的腸道微生物也有可能攜帶大量的抗生素抗性基因，并可以通過糞便排入水體或土壤環境中，進入人類環境并危害人類健康。另外，由于青藏高原地區存在牦牛(Bosgrunniens)與高原鼠兔和高原鼢鼠互食糞便的現象，因此，其攜帶的抗生素抗性基因也可以通過牦牛肉或奶制品傳遞給人類。盡管檢測野生動物腸道抗生素基因十分重要，但是還鮮有關于野生動物攜帶哪些抗生素耐藥基因的報道。

本研究中，首先通過高通量測序分析各分類水平下高原鼠兔和高原鼢鼠腸道菌群的組成和多樣性，分析其優勢菌群，并比較兩組間菌群結構和多樣性的差異。接著通過定量PCR(qPCR)量化幾種抗生素抗性基因在野生動物腸道內的濃度，最后通過冗余分析和Spearman秩相關系數判斷抗生素抗性基因和腸道菌群的相互作用關系。擬解決以下科學問題：(1)高原鼢鼠和高原鼠兔腸道微生物的組成和多樣性是否有差異；(2)兩物種中有哪些抗生素基因得以表達以及表達量的差異；(3)抗生素抗性基因與腸道微生物的關系。本論文旨在為降低和阻止野生動物腸道抗生素抗性基因的傳播和蓄積提供科學理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

在青海澤庫(海拔4 331 m，n=16)和果洛(3 856 m，n=8；3 694 m，n=16)用繩套法捕捉高原鼠兔，它們的平均體重為(139.05±41.10)g，雄性∶雌性為1.22∶1；在甘肅臨潭(3 120 m，n=20)和天祝(2 980 m，n=18)，用弓形夾捕捉高原鼢鼠，其平均體重為(145.42±25.47)g，雄性∶雌性為1∶1.24。經蘭州大學倫理委員會和動物保護協會批準后，對所有動物實施安樂死，即在野外用乙醚將動物麻醉致死并解剖動物，用無菌剪刀剪下盲腸，并立即用無菌鑷子將腸道的內容物擠到50 mL無菌管中，所有樣品均暫時凍存在-20 ℃便攜式冰箱中，并于24 h內運回實驗室，在-40 ℃冰箱保存。本次研究共收集高原鼠兔腸道內容物樣本40份和高原鼢鼠腸道內容物樣本38份。根據之前我們的研究，高原鼠兔的食物主要有棘豆屬(Oxytropis)、毛茛屬(Ranunculus)、瘤果芹屬(Trachydium)、馬先蒿屬(Pedicularis)和矮嵩草屬(Kobresia)植物[30]；而高原鼢鼠的食物主要有薔薇科(Rosaceae)(蕨麻Argentinaanserina，雪白委陵菜Potentillanivea)和禾本科(披堿草Elymus)植物[31]。

1.2 腸道微生物和抗生素基因測定

1.2.1 提取DNA

采用Ezup土壤基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech，China)提取盲腸內容物總DNA。

1.2.2 PCR擴增

使用通用引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′)和909R(5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)擴增微生物的16S rRNA基因[30]，再使用含獨特12 bp條形碼的正向引物對每個PCR產物進行標記。用10 ng DNA模板、1×PCR緩沖液、1.5 mM氯化鎂、0.4 μM的脫氧核苷酸三磷酸、1.0 μM的引物，0.25 U的Ex-Taq(大連TaKaRa)和無菌水進行25 μL PCR反應，每個樣品做2個重復。熱循環程序包括在94 ℃下初始變性3 min；然后在94 ℃下變性40 s，56 ℃下退火60 s，72 ℃下延長60 s，共循環30次；最后在72 ℃下延長10 min。

1.2.3 16S rRNA基因測序和生物信息學分析

PCR擴增后，將2個PCR產物混合在一起，使用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳。用SanPrep-DNA凝膠提取試劑盒(Sangon Biotech，China)分離純化正確的條帶(—400 bp)，并用Nanodrop 2000分光光度計定量，之后將所有樣品等量混合。按照制造商的說明，使用TruSeq DNA試劑盒制備測序文庫。純化后的樣品文庫按照Illumina文庫制備方案進行稀釋、變性、再稀釋、與PhiX(等于最終DNA量的30%)混合，然后應用Illumina Miseq測序儀進行高通量測序。

在QIIME平臺上處理原始數據(http：//qiime.org/tutorials/tutorial.html)。基于FLASH軟件對其進行雙末端拼接(paired-end序列的拼接)。根據barcode條形碼進行樣品拆分。將fastq序列轉換為fasta格式的序列，進一步用FASTS-Toolkit軟件剔除低質量的序列，和參考序列比對后去除嵌合體。使用Uclust對所有序列進行聚類，將相似度大于97%的序列聚為一種OTU。篩選出OTU代表性序列并對其進行物種注釋，用RDP數據庫對每一個OTU代表序列進行分類鑒定。剔除只含有1條序列的OTU或者不屬于細菌的OTUs。為了標準化樣本，使用daisychopper腳本將每個樣本抽取相同的序列數(5 092個序列)。使用Origin 2017，繪制門水平和屬水平上的堆積圖表示群落組成。計算群落的Chao指數(Chao index)、香農多樣性(Shannon)、可觀察到物種數(observed OTUs)和辛普森指數(Simpson)表示α多樣性。利用unweighted UniFrac和weighted UniFrac距離進行主坐標分析和計算群落相似度。

1.2.4 抗生素抗性基因DNA的提取及含量的測定

采用Ezup土壤基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech，China)提取樣本抗生素抗性基因的總DNA。用分光光度計(NanoDrop ND-2000c，Thermo Fisher Scientific，USA)和1.5%瓊脂凝膠電泳法測定DNA的濃度和質量。在-80 ℃保存高質量提取的總DNA，利用安徽微分基因科技有限公司的WaferGen SmartChip實時定量PCR系統對抗生素抗性基因進行高通量定量PCR(HTqPCR)檢測。每100 nL反應混合物含有50 nL的1 LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche Inc.，USA)，20 nL的2 ng/mL DNA模板，1 nL的0.1 mg/mL牛血清白蛋白，500 nM的正向和反向引物，以及19 nL的無核酸酶PCR級水。對于每一個引物組，擴增是在三聯體中進行的，并且包括一個非模板對照。熱處理方案包括95 ℃初始變性10 min；然后在95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共循環40次，程序自動生成熔解曲線分析[30]。抗生素抗性基因的引物如表1所示。

1.3 數據處理

使用SmartChip qPCR軟件(版本2.7.0.1)分析HT-qPCR的結果。分析中不包括具有多個熔化峰或擴增效率在1.8—2.2范圍之外的樣本。對觀察顯著熒光信號所需的周期數(閾值周期，Ct)進行了限制。只有Ct<31個周期且有2個以上重復出現擴增的樣本才被認為是陽性。

1.4 統計分析

本研究所用的統計軟件為SPSS 21.0。用單因素方差分析比較兩物種間主要腸道微生物相對豐度的差異以及種間Alpha多樣性的差異；用Mann-Whitney檢驗比較兩物種間抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene，ARGs)拷貝數的差異；通過weighted UniFrac 距離矩陣和 unweighted UniFrac 距離矩陣比較兩物種的Beta多樣性。使用PerMANOVA分析計算體重、性別和物種對腸道微生物群落結構的影響；使用冗余分析描述抗生素耐藥基因與腸道微生物相對豐度的關系，并用Spearman秩相關系數判斷抗生素抗性基因和腸道菌群的相關性，顯著性水平α=0.05。

表1 抗生素抗性基因的引物

2 研究結果

2.1 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物的組成

本次研究鑒定到38個門，758個屬，按97%的相似度聚類共篩選出15 814個OTU(剔除只含有1條序列的OTU或不屬于細菌的OTUs)，在門水平和屬水平分別選擇相對豐度大于1%和0.1%的菌群作為優勢門和優勢屬，用相對豐度描述腸道菌群的組成，其結果見圖1。

圖1(A)是門水平高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物的組成，其中主要的腸道微生物(平均相對豐度≥1%)有擬桿菌門(Bacteroidetes)(45.24%)，厚壁菌門(Firmicutes)(43.92%)，變形菌門(Proteobacteria)(4.47%)，螺旋體門(Spirochaetes)(2.12%)和放線菌門(Actinobacteria)(1.22%)；圖1(B)是屬水平兩物種腸道微生物的組成，其主要的腸道微生物(平均相對豐度≥1%)有S24-7中某屬(31.22%)，梭菌目(Clostridiales)的某科某屬(12.10%)，普雷沃氏菌(Prevotella)(7.09%)，瘤胃球菌(Ruminococcus)(6.20%)，顫螺菌屬(Oscillospira)(6.04%)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)(4.10%)某屬，瘤球菌科(Ruminococcaceae)某屬(3.09%)，擬桿菌目(Bacteroidales)某科某屬(2.17%)，丹毒科(Erysipelotrichaceae)某屬(2.09%)，密螺旋體(Treponema)(1.95%)，大腸桿菌(Escherichia)(1.47%)和YRC22屬(1.16%)。

圖2(A)，(B)和(C)分別代表了在門，屬和OTU水平兩物種共有的和特有的微生物。本次研究中，在門水平，僅出現在高原鼠兔中的有20個門，僅出現在高原鼢鼠中的有1個門，同時出現在2個物種中的門有17個；在屬水平，高原鼠兔特有的屬有503個，而高原鼢鼠特有的屬有54個，共有的屬有201個；在OTU水平，高原鼠兔特有的OTU的個數為10 622個，高原鼢鼠特有的OTU的個數為4 287個，共有的OTU共905個。原始的16S rRNA 基因下機fastq序列已經遞交到歐洲核苷酸數據(European nucleotide archive)，登錄號為PRJEB39107。

圖1 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道菌群的組成Fig.1 Composition of gut microbes of plateau pika and plateau zokor

圖2 高原鼠兔和高原鼢鼠共有及特有的腸道菌群種類數Fig.2 Number of species of shared and unique gut microbes in plateau pika and plateau zokor

為了探究高原鼠兔或高原鼢鼠主要的腸道菌群在兩物種間是否存在差異，本研究在門(平均相對豐度≥0.1%)、屬(平均相對豐度≥1%)和OTU(平均相對豐度≥0.1%)水平分別比較了兩物種主要腸道微生物，找出有顯著差異的腸道菌群，這些腸道菌群的相對豐度在高原鼠兔和高原鼢鼠中有顯著差異。由于OTU水平下有差異的微生物類群較多，因此，僅取平均相對豐度差異最大的20個，結果見圖3。在門，屬和OTU水平兩動物物種主要腸道菌群的差異。在門水平，高原鼢鼠的擬桿菌門的平均相對豐度更高；而高原鼠兔的厚壁菌門，放線菌門，疣微菌門(Verrucomicrobia)和軟壁菌門(Tenericutes)的平均相對豐度更高。在屬水平，高原鼢鼠的擬桿菌屬(Bacteroides)和S24-7中某屬平均相對豐度高于高原鼠兔；而高原鼠兔的普雷沃氏菌，顫螺菌屬，YRC22，瘤球菌科某屬，擬桿菌目某科某屬和丹毒科的平均相對豐度高于高原鼢鼠。在OTU水平，高原鼠兔的OTU1_Prevotella(普雷沃氏菌)，OTU2_Bacteroidetes(擬桿菌門)，OTU3_Clostridiales(梭菌目)，OTU4_Clostridiales(梭菌目)，OTU5_Prevotella(普雷沃氏菌)，OTU6_Prevotella(普雷沃氏菌)，OTU7_Oscillospira(顫螺菌屬)，OTU8_Prevotella(普雷沃氏菌)，OTU9_Clostridiales(梭菌目)、OTU10_Prevotella(普雷沃氏菌)更豐富；而高原鼢鼠的OTU11_S24-7，OTU12_Plebeius，OTU13_Bacteroidetes(擬桿菌門)，OTU14_Lachnospiraceae(毛螺菌科)，OTU15_S24-7，OTU16_copri，OTU17_S24-7，OTU18_S24-7，OTU19_S24-7，OTU20_Clostridiales(梭菌目)更豐富。

2.2 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物多樣性比較

本次研究用Chao指數(Chao index)，觀察到的物種數(observed OTUs)，香農指數(Shannon)，辛普森指數(Simpson)4個α多樣性指數描述并比較兩物種的α多樣性。高原鼠兔腸道菌群的α多樣性顯著高于高原鼢鼠，結果如圖4所示。比較高原鼠兔和高原鼢鼠的β多樣性，由表2可知，性別和體重對腸道微生物群落結構沒有顯著影響，但是物種對腸道微生物群落結構有顯著影響，圖5也顯示高原鼠兔和高原鼢鼠群落結構有顯著差異。

2.3 高原鼠兔和高原鼢鼠體內抗生素抗性基因含量

共選取高原鼢鼠和高原鼠兔各7只檢測抗生素抗性基因，我們總共檢測了11種抗生素基因，但是在高原鼠兔和高原鼢鼠中只檢測到了6類抗生素抗性基因(圖6)，分別是tetQ(抗四環素類)，tetM-01(抗四環素類)，tetG-01(抗四環素類)，sul1(抗磺胺類)，sul2(抗磺胺類)和floR(多重耐藥)，除了tetQ的含量在兩物種間有差異外，其余抗生素抗性基因在兩物種間均無差異。

2.4 高原鼠兔和高原鼢鼠體內抗生素抗性基因和腸道菌群的關系

本研究分別在門(圖7-A)，屬(圖7-B)和OTU水平(圖7-C)判斷高原鼠兔和高原鼢鼠主要腸道微生物和抗生素抗性基因的關系(門水平：平均相對豐度≥0.1%；屬水平：平均相對豐度≥1%；OTU：平均豐度≥0.1%，在兩物種中平均相對豐度差別最大的10個)。其相關關系見表3，表4，表5。在門水平，tetQ與擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度呈正相關，與藍細菌(Cyanobacteria)和酸桿菌(Acidobacteria)的相對豐度呈負相關，其余抗生素抗性基因與腸道菌群的相關性均不顯著；在屬水平，tetQ與普雷沃氏菌、瘤球菌科某屬、擬桿菌目某屬以及YRC22的相對豐度均呈負相關，sul1與毛螺菌科某屬的相對豐度呈正相關，floR與顫螺菌屬的相對豐度呈正相關；在OTU水平，tetQ與OTU1_Prevotella、OTU2_Bacteroidetes、OTU3_Clostridiales、OTU4_Clostridiales和OTU5_Prevotella的相對豐度呈負相關，與OTU16_copri、OTU17_S24-7、OTU18_S24-7、OTU19_S24-7和OTU20_Clostridiales的相對豐度呈正相關，tetM-01與OTU16_copri的相對豐度呈正相關。

表2 性別、體重及物種對群落結構的影響

圖3 主要的腸道微生物在高原鼠兔和高原鼢鼠中的差異Fig.3 Differences of main gut microbes between plateau pika and plateau zokor

圖4 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道菌群α多樣性的比較Fig.4 Comparison of gut microbes α diversity between plateau pika and plateau zokor

圖5 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道菌群群落結構的差異Fig.5 Differences of community structure of gut microbes between plateau pika and plateau zokor

圖6 高原鼠兔和高原鼢鼠體內抗生素抗性基因的含量Fig.6 Quantity of antibiotic resistance genes in plateau pika and plateau zokor

圖7 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物與抗生素抗性基因的關系Fig.7 Relationship between gut microbes and antibiotic resistance genes in plateau pika and plateau zokor

表3 門水平抗生素抗性基因和腸道微生物的關系

表4 屬水平抗生素抗性基因和腸道微生物的關系

表5 OTU水平抗生素抗性基因和腸道微生物的關系

3 討論

3.1 高原鼠兔和高原鼢鼠腸道微生物組成和多樣性有差異

高原鼠兔和高原鼢鼠腸道菌群的組成在門、屬和OTU水平均有差異，這一差異有可能是由二者屬于不同的物種，且膳食結構和生活環境不同造成的，因為宿主的種類、膳食結構以及環境等因素都是腸道微生物結構的重要影響因素[11]。第一，高原鼠兔屬于鼠兔科；而高原鼢鼠屬于倉鼠科，二者屬于不同的物種。第二，高原鼠兔主要棲息在地上，以植物葉、莖、花、根、芽為食，較少攝入種子；而高原鼢鼠主要棲息于地下，以植物根、皮、莖、葉、果實和種子為食，這兩個物種的食物與生活的環境有差異。物種、飲食及生活環境的差異可能導致兩物種腸道菌群的組成有差異。

在本次研究中，高原鼠兔和高原鼢鼠的α多樣性也有顯著差異，高原鼠兔腸道菌群的α多樣性高于高原鼢鼠。而腸道微生物往往因宿主基因型、宿主生理狀態、宿主生活方式和宿主所處的環境因素等的改變而改變[32]，兩物種的基因型、生理狀態和生活環境的差異可能導致二者腸道微生物多樣性的不同。宿主的膳食也是影響腸道微生物多樣性的重要因素，食物中的營養成分可能影響腸道微生物的多樣性[33-34]。另外，比起高原鼢鼠，高原鼠兔生存的外部草原環境更復雜，海拔更高，氣候更加惡劣，食物更匱乏，因此可能會接觸到更多的環境微生物，有可能獲得更多的環境微生物定植，進而提升了腸道微生物的多樣性。在其他研究中，盡管高原鼠兔食物的多樣性低于達烏爾鼠兔(Ochotonadaurica)，但其腸道微生物多樣性卻高于后者。這可能是由于高原鼠兔在高海拔地區需要更多的能量，而其腸道微生物需要更加充分地發酵簡單的食物，促進高原鼠兔對高海拔環境的適應性，而腸道微生物多樣性提高可以提升發酵效率[30]。同樣，比起高原鼢鼠，高原鼠兔的生活環境海拔更高，因而腸道菌群的多樣性更高，這可能是由于海拔影響了食物的組成[35]，繼而影響了腸道微生物的多樣性。

高原鼠兔和高原鼢鼠的群落結構有顯著差異，兩物種間群落結構差異度大，但同一物種內群落結構相似度高。由于高原鼠兔和高原鼢鼠分屬不同的物種，基因型不同，這一差異可能導致腸道菌群群落結構的不同[32]。如在實驗室環境中，來自同一繁殖群體或供應商的幼鼠基因相似度高，其微生物群落結構比其他小鼠具有更高的相似度[36]。膳食結構也是腸道菌群群落結構的重要影響因素，在自然環境中膳食結構更相似的個體腸道菌群具有更高的相似度[35]，高原鼠兔和高原鼢鼠飲食結構的差異可能是造成這一現象的原因。

3.2 部分腸道菌群同時在高原鼠兔和高原鼢鼠腸道內富集，這些微生物提高了它們消化植物性食物的能力

在不同分類水平上，高原鼠兔的腸道微生物種類比高原鼢鼠更為豐富。高原鼠兔和高原鼢鼠有一部分共有的腸道菌群，也有各自特有的微生物群。有研究發現不同動物機體內都有特定微生物群，大約70%的微生物具備種群特異性，但其豐度不超過0.5%，動物機體內的微生物群的系統發育和功能組成在出生后趨于平衡，在斷奶后逐漸平穩，微生物種類和數量相對穩定。其中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門3個門類屬于優勢菌群，也是核心微生物。它們調節了腸道菌群生物多樣性，有利于腸道菌群的穩定[37]。

在門水平，厚壁菌門和擬桿菌門是高原鼠兔和高原鼢鼠的優勢菌群。且甘肅鼢鼠(Eospalaxfontanieriicansus))腸道菌群在門水平相對豐度位居前二的也是厚壁菌門和擬桿菌門[38-39]；而厚壁菌門和擬桿菌門也是其他植食性哺乳動物如馬(Equus)[40]、驢(donkey)[41]、梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[42]的優勢菌群。甘肅鼢鼠又稱羅氏鼢鼠，屬于倉鼠科，鼢鼠屬，是一類長期生活在地下的雜食性動物，其食物往往是富含纖維素的植物根系[43]，食性與高原鼢鼠相似；馬、驢和梅花鹿均是常見的植食性動物，其食物富含纖維素。因而，纖維素的消化吸收對以上幾種動物而言尤為重要。腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門對動物消化食物中的纖維素有促進作用[42]。

在屬水平，類桿菌科(Bacteroidaceae)S24-7的某屬、普雷沃氏菌、瘤胃球菌以及顫螺菌屬是優勢菌群，S24-7分布局限，主要存在于恒溫動物的腸道內，且數量上在腸道菌群中占據主導地位，且S24-7中有多種細菌可以增加降解碳水化合物酶的相對含量[44]。高原鼢鼠和高原鼠兔均屬于恒溫動物，且它們的食物中富含纖維素等碳水化合物，因而S24-7平均相對豐度高。普雷沃氏菌和瘤胃球菌均屬于瘤胃纖維性分解菌[45]，它們往往擁有不同的纖維素酶和半纖維素酶基因[46]，幫助宿主消化植物纖維素并從中汲取能量。其中普雷沃氏菌往往不能直接消化纖維素，但在低pH下可以降解纖維素衍生物羧甲基纖維素，同時，普雷沃氏菌催化結構域能和來自熱單孢菌(Thermomonsporafusca)的結合結構域的重組酶結合，并擁有至少10倍的纖維素酶活性[47]。而顫螺菌屬則在纖維素發酵過程中也具有一定作用[48]。由于高原鼠兔和高原鼢鼠食物中的主要成分為纖維素，因而以上幾類細菌有較高的相對豐度。

3.3 在高原鼠兔和高原鼢鼠體內均檢出抗生素抗性基因

本研究在高原鼠兔和高原鼢鼠體內檢測到抗生素抗性基因共6種，其中四環素類抗性基因3種，分別是tetQ，tetM-01和tetG-01；磺胺類的抗性基因2種，分別是sul1和sul2；還有一類多重耐藥基因floR。動物可以由自身腸道微生物合成抗生素抗性基因，比如動物體內產生抗生素的細菌可以編碼抗生素抗性基因，以保護它們免受自身產生的生物活性分子的影響，抗生素耐藥基因產生后不可避免地在病原菌中傳播[49]。動物也可以從外界環境中獲得抗生素抗性基因，由于抗生素在畜牧業和養殖業中的長期濫用，在養殖動物腸道內誘導出可以編碼抗生素抗性基因的抗性菌株，這些菌株隨糞便排泄，再經雨水沖刷，地表徑流和大氣擴散等多種途徑進入到環境中并被動物攝取，這些編碼抗生素抗性基因的菌株是環境中抗生素抗性基因最重要的來源。抗生素抗性基因可以通過質粒的水平交換從一種細菌轉移到人類或家畜微生物群[50-51]，因此，高原鼠兔和高原鼢鼠體內的抗生素抗性基因可能源自以上兩種途徑。

3.4 腸道微生物和抗生素抗性基因的關系

有研究發現，抗生素抗性基因普遍存在于農場動物的腸道微生物中[52-53]，而高原鼠兔和高原鼢鼠與牦牛相互食糞的行為可能導致其腸道菌群中存在抗生素抗性基因。動物微生物群中的耐藥細菌因此可以作為抗生素抗性基因重要的貯存庫[54]。而這些病原菌可以通過水平基因轉移或交換質粒將抗生素抗性基因轉移到腸道菌群中使腸道菌群攜帶抗生素抗性基因，有研究表明人類腸道中大量的微生物充當著抗生素抗性基因的儲存庫[55]，因此高原鼠兔和高原鼢鼠的腸道微生物也有可能成為抗生素抗性基因的貯存庫。

擬桿菌、顫螺菌屬等腸道菌群的相對豐度與抗生素抗性基因呈正相關，它們有可能是抗生素抗性基因的貯存庫，或者與攜帶抗生素抗性基因的病原微生物有協同作用，而藍細菌、放線菌、普雷沃氏菌、瘤球菌科的某屬、擬桿菌目的某屬YRC22等腸道微生物的相對豐度與抗生素抗性基因呈負相關，這些腸道菌群則可能與攜帶抗生素抗性基因的病原菌相互拮抗，阻止了抗生素抗性基因的積累。通過調節高原鼠兔和高原鼢鼠的腸道微生物，比如適當減少擬桿菌的相對含量或增加放線菌的相對含量，可能阻止抗生素抗性基因的富集與傳播，降低抗生素抗性基因向人類傳播的機會，減少抗生素抗性基因對人體的危害。

致謝：感謝實驗室各位老師和同學在實驗和數據分析上提供的幫助。