miR-320a 在人結腸癌細胞中的生物學行為及對癌基因FOXQ1 的靶向調控機制

劉寧 陳華 呂文（通訊作者）

（深圳市人民醫院急診科 廣東 深圳 518000）

結腸癌是一種常見消化道惡性腫瘤，致死率較高，且預后差、腫瘤轉移復發為致死重要原因[1]。當前，臨床尚未具體明確結腸癌發病機制，影響疾病早期診治。微小RNAs（miRNAs）屬于生物體內一種內源性非編碼小核糖核酸，可直接靶向作用于mRNA 互補序列3'-UTR，經由對靶基因翻譯進行降解、控制，發揮抑制靶基因表達作用[2]。而miR-320a 是一類經典抑癌基因，在多種腫瘤細胞中呈低表達，且與腫瘤細胞增殖、轉移密切相關[3]。FOXQ1 在人體細胞代謝、凋亡、癌變等生物學行為中發揮重要作用，且與腫瘤發生密切相關，特別是在結腸癌中，受多種因子調控。本研究就該問題進行分析，探討結腸癌腫瘤細胞中miR-320a生物學行為，并分析對癌基因FOXQ1的靶向調控機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用ATCC 細胞庫提供的人HCT116 結腸癌細胞株。試劑包括福麥斯生物科技有限公司PCR 熒光定量試劑盒、美國Abcam 公司FOXQ1、武漢博士德公司McCoy's 5A 培養基、上海吉馬公司人miR-320a mimics 及陰性對照小干擾RNA 等。儀器包括日本Nikon 公司倒置常規顯微鏡、美國Applied Biosystems 公司熒光定量PCR 儀等。

1.2 實驗方法

（1）細胞株培養、傳代及轉染：HCT116 結腸癌細胞株以McCoy's 5A 培養基，在37℃、5% CO2細胞培養箱內培養。細胞融合80%～90%，經EDTA 胰酶消化，行常規傳代培養。根據脂質體2000 試劑說明書，將人miR-320a mimics 轉染miR-320a 低表達HCT116 細胞，對照組為NC 轉染細胞，轉染完成后6h，調整成完全培養基。

（2）miR-320a 表達檢測：HCT116-mimics、HCT116-NC 組結直腸細胞總RNA 均經Trizol 法提取。根據cDNA 合成試劑盒，實施逆轉錄反應。采用定時熒光定量PCR 法檢測miR-320a 表達，采用qPCR SuPerMix 進行實時定量PCR 反應，U6 為檢測miR-320a 指標，GAPDH 為檢測FOXQ1 指標。各樣本中miR-320a、FOXQ1 相對表達量采用目的基因表達量=2-△△△計算，各組檢測3個復孔取均值。

（3）細胞增殖、平板克隆形成實驗：轉染24h，在96 孔板上接種HCT116 細胞，各孔均加入溶液，置入37℃培養箱培養，共48h。細胞活力以CCK-8 法檢測，各組檢測3 個復孔取均值。將對數生長期HCT116 細胞制備為單細胞懸液，計數成103個細胞，在6cm2培養皿內接種2 周，甲醇固定，1g/L 結晶紫染色，計算肉眼可見克隆形成數，形成率為（克隆數/接種細胞數）×100%。

（4）細胞侵襲及熒光素酶報告基因檢測：取轉染后細胞，培養24h，制備成單細胞懸液，在Traswell 小室內接種，以無血清McCoy's 5A 培養基200μL 加入上室，以含10% FBS的McCoy's 5A 培養基500200μL 加入下室，置入37℃培養箱24h；結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計算穿膜細胞數，各組檢測3 個復孔取均值。并行熒光素酶報告基因實驗，采用酶標儀檢測熒光強度，觀察并記錄數據，各組檢測3 個復孔取均值。

1.3 統計學分析

2.結果

2.1 miR-320a 對HCT116 結腸癌細胞增殖的作用

轉染miR-320a mimics 后HCT116 細胞數少于陰性對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表1。HCT116-mimics 組細胞活力低于HCT116-NC 組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

表1 miR-320a mimic 組、陰性對照組HCT116 細胞數對比（）

表1 miR-320a mimic 組、陰性對照組HCT116 細胞數對比（）

組別 例數 HCT116 細胞數miR-320a mimics 組 3 43.51±14.26陰性對照組 3 228.58±18.67 t-13.654 P-0.000

表2 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組細胞活力對比（）

表2 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組細胞活力對比（）

組別 例數 細胞活力HCT116-mimics 組 3 0.51±0.13 HCT116-NC 組 3 1.03±0.15 t-4.537 P-0.005

2.2 miR-320a 對HCT116 結腸癌細胞侵襲的作用

HCT116-mimics 組穿膜細胞數少于HCT116-NC 組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表3。

表3 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組穿膜細胞數對比（）

表3 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組穿膜細胞數對比（）

組別 例數 穿膜細胞數HCT116-mimics 組 3 0.38±0.05 HCT116-NC 組 3 1.02±0.11 t 9.174 P 0.000

2.3 HCT116 結腸癌細胞中miR-320a 與FOXQ1 間關系

miR-320a mimics 組熒光酶活性低于陰性對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表4。Western blot 實驗顯示，上調miR-320a可促使HCT116細胞內FOXQ1蛋白表達水平降低，見圖1。

表4 miR-320a mimics 組、陰性對照組熒光酶活性對比（）

表4 miR-320a mimics 組、陰性對照組熒光酶活性對比（）

組別 例數 熒光酶活性miR-320a mimics 組 3 0.41±0.03陰性對照組 3 1.01±0.09 t-10.954 P-0.000

圖1 上調miR-320a 可抑制HCT116 結腸癌細胞內FOXQ1 蛋白表達

3.討論

結腸癌是一種常見病、多發病，全世界每年新診斷病例達60 萬，國內惡性腫瘤中患病率、死亡率均居第四位[4]。而臨床探索參與結腸癌細胞生長、增殖、侵襲轉移的分子機制，探尋與增殖、侵襲相關新型靶基因，以指導治療方案制定，提升患者生存率，具有重要意義。miRNA 屬于18-24 核苷酸長度小片段非編碼RNA，能對靶基因轉錄進行抑制，或促進靶基因降解。較多研究發現，結直腸癌中存在較多miRNA 異常表達，且參與調節腫瘤細胞的生物學行為[5-7]。而miR-320a 是一種新近發現的miRNA，被證實在多種癌癥（含結腸癌）中存在表達下調現象，認為其可經多通路抑制結腸癌發展進程[8]。

FOXQ1 為叉頭框轉錄因子家族成員之一，在人體多組織及器官內廣泛分布，主要定位于人類染色體6P25.3，編碼一種功能性氨基酸蛋白，參與人體細胞生長、代謝、凋亡或癌變等生物學過程。研究發現，FOXQ1 激活可對下游基因產生影響，在腫瘤細胞生成、增殖、侵襲及轉移中發揮重要作用，且在結直腸癌、乳腺癌等較多腫瘤中存在高表達[9]。結腸癌中，FOXQ1 受多種因子調控，如TGF-β 等，但臨床就結腸癌中miR-320a 是否也為FOXQ1 調控因子，尚無明確定論。而生物信息軟件提示，FOXQ1 3'端非翻譯區存在miR-320a 潛在結合位點。故本研究提出結腸癌中上調miR-320a 可抑制FOXQ1 表達的假設，并進行驗證。調查發現，轉染miR-320a mimics 后HCT116 細胞數明顯較陰性對照組少，說明上調miR-320a 表達，能對結腸癌細胞增殖進行抑制。而且，HCT116-mimics 組細胞活力較HCT116-NC 組低，也提示miR-320a mimics 可抑制HCT116 細胞活力。此外，HCT116-mimics 組穿膜細胞數較HCT116-NC 組少，提示miR-320a mimics可降低HCT116 細胞侵襲能力。本研究還實施雙熒光素酶報告基因實驗，以驗證FOXQ1 是否為miR-320a 直接靶基因，調查發現，miR-320a mimics 組熒光酶活性低于陰性對照組，而上調miR-320a 可促使HCT116 細胞內FOXQ1 蛋白表達水平降低，這說明FOXQ1為miR-320a一個直接靶標，與湯增秋等[10]結果相符。因此，筆者認為，miR-320a 對結腸癌細胞生物學功能調控中，靶向抑制FOXQ1 基因也是一個重要途徑，能為結腸癌中miR-320a 作用機制提供新方向。

綜上所述，結腸癌中，miR-320a可抑制腫瘤細胞增殖及侵襲，且作用機制可能與靶向抑制FOXQ1基因有關，值得進行深入研究。