色素上皮衍生因子在腦膠質瘤中的表達及其對膠質瘤治療作用的研究

孫廣玉 王淑燕 李九州 張萍 張瑩瑩

（山東省濱州市人民醫院 山東 濱州 256600）

腦膠質瘤是神經外科最常見的中樞神經系統腫瘤，具有侵襲性和復發性，早期難以通過影像診斷而被發現。目前膠質瘤的治療以手術切除為主，輔以化療放療及免疫治療和生物治療等措施。這些方法的治療效果并不令人滿意，主要是治療后易復發，復發后的腫瘤其惡性程度進一步增加。因此，尋找一種新的、更有效的生物治療方法，是當前臨床迫切需要解決的問題[1]。最近的研究表明，色素上皮衍生因子（PEDF）可以誘導分化并抑制幾種腫瘤的血管生成[2]。然而，PEDF 在膠質瘤中的角色仍需進一步研究。在腫瘤血管生成過程中，血管生成相關因子發揮重要的調控作用。這些細胞因子可分為兩大類：一類為促進因子如血管內皮生成因子VEGF，另一類為抑制因子例如PEDF、血小板反應蛋白TSP-1[3]。這兩類因子在膠質瘤發展過程中是否具有相互調控作用尚不清楚，了解它們之間的調控關系將在抗血管生成方面為腦膠質瘤的有效治療提供有力證據。因此，本文著重探討色素上皮衍生因子（PEDF）在腦膠質瘤患者組織中的表達與臨床病癥的相關性及其對膠質瘤血管生成方面的調控作用。

1.資料與方法

1.1 一般資料

在患者知情同意下，選擇2017 年5 月—2018 年12 月我院收治的80 例腦膠質瘤患者，收集它們的臨床資料。術后的腦膠質瘤組織行免疫組織化學染色檢測PEDF 的表達。在進行PEDF 的表達與臨床病理特征相關性分析時，主要從性別、年齡、臨床分期等方面進行評估。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞樣品的獲得 將重組蛋白rPEDF 加入腦膠質瘤細胞A172 中（A172PEDF），同時以未加入PEDF 蛋白的腦膠質瘤細胞作為對照（A172con），24 小時后取培養液并收集細胞分別檢測VEGF、TSP-1 胞外分泌量和細胞內表達量。

1.2.2 酶聯免疫吸附實驗 根據試劑盒說明書，取細胞培養液加入單抗包被的檢測孔內，經過孵育、加生物素標記的二抗、孵育、加反應液和終止液等步驟，在酶標儀上測定每孔吸光度（A）值，按標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.3 蛋白免疫印跡 收取的細胞加入RIPA 裂解液冰上裂解30min 后，BCA 法進行總蛋白定量后，變性并煮沸后的蛋白樣品經SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉、孵育第一抗體和第二抗體步驟后，顯色檢測蛋白表達情況。蛋白條帶用Image J 軟件進行灰度分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism7 軟件進行數據處理，計數資料行χ2檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t 檢驗，采用（）表示，P ＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 PEDF 的表達與腦膠質瘤患者的臨床病理特征分析

為了研究PEDF 在腦膠質瘤發展中的作用，我們對80 份膠質瘤組織切片行免疫組織化學染色以測定PEDF 的表達。通過配對患者的臨床資料特征后，我們將PEDF 的陽性表達與患者的臨床病癥進行相關性分析。數據分析表明，腦膠質瘤患者的PEDF的表達與性別、年齡無關，而與膠質瘤的臨床分期有一定的相關性（P ＜0.05）。這一結果提示，PEDF 在惡性程度較低的患者腦膠質瘤組織中表達相對豐富，見表1 和圖1。

表1 PEDF 的表達與腦膠質瘤患者的臨床病理特征分析

圖1 PEDF 的表達與腦膠質瘤患者臨床分期的相關性

2.2 PEDF 對腦膠質瘤細胞中的VEGF 和TSP-1 表達的調控

為了進一步探討PEDF 對腦膠質瘤發展的調控作用，我們用體外重組蛋白rPEDF 處理膠質瘤細胞，并檢測血管生成相關因子的表達。經免疫吸附法測定后，相比于A172con，A172PEDF 細胞培養液中VEGF 含量有所減少，TSP-1 的含量有所增加（P ＜0.05）。蛋白免疫印跡實驗可以得到類似的結果，相比于對照組，在A172PEDF 細胞中，VEGF 的表達顯著降低，而TSP-1 的表達則顯著上升，見表2 和圖2。我們的結果表明，PEDF 可通過調控血管生成關鍵因子的表達發揮抗腫瘤作用。

表2 rPEDF 對腦膠質瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（）

表2 rPEDF 對腦膠質瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（）

注：（細胞外分泌，單位μg/ml）

檢測項目 A172con A172PEDF VEGF 1.23±0.06 0.66±0.09 TSP-1 346±87 1848±142 P＜0.05 ＜0.05

圖2 rPEDF 對腦膠質瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（細胞內，A172con 為對照）

3.討論

本研究中，通過對腦膠質瘤患者的臨床病癥與他們膠質瘤組織中PEDF的表達進行相關性分析證實PEDF的表達與患者性別、年齡無關，而與臨床分期有一密切的關系（P ＜0.05）。同時，通過分子生物學手段探究了PEDF 對腦膠質瘤細胞中某些癌癥發生發展相關分子表達的調控作用，證實PEDF 可調節VEGF 的下調表達，同時上調TSP-1 的表達（P ＜0.05）。

臨床研究證明，PEDF 在正常腦組織的表達量是膠質瘤組織中的數倍[4]。這與我們的研究結果有相似之處，即惡性程度低的膠質瘤組織中PEDF 蛋白表達陽性率反而更高。PEDF 在中樞神經系統的作用主要包括促進神經元細胞存活、充當視網膜母細胞瘤細胞的神經營養蛋白，因此在膠質瘤組織中PEDF 的低表達可能是導致膠質瘤發展的重要因素[5]。此外研究證實，PEDF 既是一種神經營養因子，又是一種內源性新生血管抑制劑[6]。與PEDF 抑制新生血管生成、抗腫瘤和促進腫瘤細胞分化等多種功能不同的是，VEGF 可促進血管內皮細胞增殖、分化從而促進新生血管形成，在腫瘤的生長、浸潤和轉移過程中起到重要作用。最新的研究也顯示它在中樞神經系統腫瘤中發揮重要的調控作用[7]。TSP-1 作為首先被發現的內源性抗血管生成因子之一，它具有抑制內皮細胞增殖、遷移和毛細血管形成的功能。我們的研究證實，在膠質瘤細胞中，PEDF 可顯著調控VEGF 和TSP-1 的表達。這樣，PEDF可以在抑制血管生成方面發揮抑制腫瘤的作用。然而，本研究仍然存在不足，例如缺乏體內實驗的依據。我們計劃下一步開展PEDF 對裸鼠膠質瘤模型的治療研究。

綜上所述，基于臨床分析和細胞學實驗結果表明，PEDF 與腦膠質瘤患者疾病嚴重程度密切相關，同時是影響腫瘤新生血管形成的主要調控因子。PEDF 表達情況與膠質瘤的惡性程度及血管生成呈負相關，PEDF有可能成為膠質瘤生物學治療的一種有效的新方法。