高效液相色譜法測定黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷

余功富

(臺州市路橋區橫街動物衛生所，浙江 臺州 318056)

黃連解毒散由黃連、黃芩、梔子和黃柏通過一定的工藝制得[1]。具有瀉火解毒的功效[2]，臨床主要用于三焦實熱[3-4]，瘡黃腫毒[5-6]。該品種質量標準收載于《中國獸藥典》2015年版二部[1]，標準采用薄層色譜法分別對黃芩、黃連和梔子苷進行定性，采用三種不同的色譜系統和提取方法，用到乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、丁酮、乙醇、丙酮、甲酸、甲苯等近10種溶劑，環境污染嚴重，操作繁瑣，對操作人員人身傷害比較大。未對黃芩苷和梔子苷等進行含量測定，不能全面評價藥物質量，控制方法不完善[7-8]。

高效液相色譜法快捷、準確、靈敏度高，定性和定量均準確。但未見文獻報道利用高效液相色譜法測定黃連解毒散中的黃芩苷和梔子苷。高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)因其結合了光譜掃描和數據庫功能，定性更準確，在獸藥檢驗中將發揮更大的優勢。本試驗采用HPLC-DAD法對黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷同時檢測的方法進行了研究，為黃連解毒散質量控制提供數據。

1 儀器與材料

1.1儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD檢測器；XS205電子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH計(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑與材料 乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%雙氧水均為分析純;實驗用水為milli-Q超純水。黃芩苷對照品，來源中國獸醫藥品監察所，批號Z0271705，含量96.8%；梔子苷對照品，來源中國食品藥品檢定研究院，批號110749-201115，含量99.7%。黃連解毒散，來源浙江博信藥業股份有限公司，批號為20181001、20181002和20181003；來源杭州愛力邁動物藥業有限公司，批號為T191001、T191002和T191003。

2 方法與結果

2.1對照品溶液的配制 取黃芩苷對照品12.650 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，定容；取梔子苷對照品7.00 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成對照品儲備液。

2.2供試品溶液的配制 精密稱取供試品約0.2 g于100 mL量瓶中，50%甲醇溶液適量，超聲處理10 min，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見表1；進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測器進行掃描，掃描范圍為200～400 nm，記錄240 nm波長處的色譜圖。該色譜條件下梔子苷和黃芩苷峰分離良好。對照品溶液色譜圖見圖1，保留時間14.777 min的為梔子苷，保留時間19.634 min的為黃芩苷，梔子苷光譜圖見圖2，黃芩苷光譜圖見圖3；供試品溶液色譜圖見圖4，供試品溶液中梔子苷光譜圖見圖5，供試品溶液中黃芩苷光譜圖見圖6。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 梔子苷和黃芩苷對照品溶液色譜圖

圖2 梔子苷對照品溶液光譜圖

圖3 黃芩苷對照品溶液光譜圖

圖4 黃連解毒散色譜圖

圖5 黃連解毒散中梔子苷光譜圖

圖6 黃連解毒散中黃芩苷光譜圖

2.4方法學考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取對照品儲備液適量，用50%甲醇稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍。制成相應濃度的系列標準品溶液，從低濃度到高濃度依次進樣分析，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程和相關系數，結果梔子苷在2.790～139.6 μg/mL濃度范圍內線性良好，線性方程Y=12.36546X-10.12365，相關系數為0.999 79；黃芩苷在2.450～122.5 μg/mL濃度范圍內線性良好，線性方程Y=13.23336X+31.11254，相關系數為0.999 68。

2.4.2精密度試驗 取批號為T191001黃連解毒散供試品溶液，按上述色譜條件重復連續進樣6次，測得梔子苷峰面積相對標準偏差為0.7%，黃芩苷峰面積相對標準偏差為0.4%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.4.3穩定性試驗 取批號為T191001黃連解毒散供試品溶液，分別于0、2、4、6、12和24 h進行測定，測得梔子苷峰面積相對標準偏差為0.8%，測得黃芩苷峰面積相對標準偏差為1.0%。表明供試品溶液穩定性良好。

2.4.4方法專屬性 取T191001黃連解毒散各0.1 g，置25 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，用50%甲醇溶液定容，依法測定。梔子苷和黃芩苷在鹽酸溶液和過氧化氫溶液中均穩定，含量減少在3%以內；在氫氧化鈉溶液中，黃芩苷和梔子苷含量均減少約50%。

2.4.5加樣回收率 取梔子苷和黃芩苷各適量，加甲醇配制成約1 mg每毫升的加樣回收率試驗溶液。另取批號為T191001的黃連解毒散樣品6份，各0.1 g，分別精密加入加樣回收率試驗溶液各2 mL，置100 mL量瓶中，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下條件檢測，結果扣除黃連解毒散樣品原有相應組分的量，計算平均回收率及RSD，結果梔子苷平均回收率為98.5%，RSD為1.6%；黃芩苷平均回收率97.8%，RSD為1.1%。

2.4.6實際樣品的測定 取批號為T191101、T191102、T191103、20181001、20181002和20181003的黃連解毒散3個平行，各0.2 g，按照“2.2”項下方法配制供試品溶液，依法檢測，記錄色譜圖，按外標法計算梔子苷和黃芩苷含量，結果見表2。

表2 樣品中含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 本試驗選擇了水、甲醇、50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈(分別由1、2、3、4、5代表)超聲處理20 min，結果見圖7。梔子苷在甲醇中提取效率較低，約50%，50%乙腈提取效率90%以上，但峰形較差，其他幾種溶劑均較好；黃芩苷在水中提取效率很低，只能提取出10%左右；在50%乙腈中提取效率在30%左右，其余溶劑均較好。因此，綜合考慮，選擇50%甲醇作為黃連解毒散供試品的提取溶劑。在這基礎上，做了超聲時間的確認，試驗分別超聲處理5 min、10 min、20 min和30 min，結果無顯著差異，見圖8。因此，超聲處理時間定為10 min。

圖7 提取溶劑對含量的影響

圖8 超聲處理時間對含量的影響

3.2檢測波長 本試驗采用DAD檢測器對梔子苷、黃芩苷和連翹苷進行全波長掃描，結果發現，梔子苷在240 nm波長有最大吸收，黃芩苷在215 nm-277 nm、316 nm波長處有最大吸收，綜合考慮每個藥物的響應值及雜質干擾因素，選擇240 nm作為檢測波長。

3.3流動相的選擇 考察了乙腈與0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液等酸溶液作為流動相，各流動相保留時間和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值為1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值為1.7，pH值小于2.0對色譜柱損害較大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值為2.3左右。因此，選擇0.05%磷酸溶液-乙腈作為流動相，調節流動相比例，兩種藥物分離較好，保留時間比較合適。最后，確定梯度洗脫程序。

4 結論

本文采用HPLC-DAD法對黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷進行檢測，對提取溶劑、提取方式、檢測波長、專屬性和色譜條件等進行研究，結果表明該方法定性定量準確，適用于黃連解毒散中的梔子苷和黃芩苷的含量檢測。