圈養(yǎng)白額雁約翰遜不動(dòng)桿菌分離鑒定與藥敏分析

黃 萃 伍思華 李 鈺 黃海玲 鄔向東

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南昌，330045；2.南昌市動(dòng)物園，南昌，330029)

不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)為非發(fā)酵型、嚴(yán)格需氧的革蘭陰性球桿菌，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、無(wú)動(dòng)力，生存能力強(qiáng)，在環(huán)境中普遍存在，并且具有廣泛的耐藥性[1]。不動(dòng)桿菌在醫(yī)院內(nèi)廣泛流行，是世界范圍內(nèi)引起院內(nèi)感染最重要的條件致病菌之一[2-3]。但是在獸醫(yī)臨床上的報(bào)道較少，1995年廣東某養(yǎng)殖場(chǎng)鱖魚(Sinipercachuatsi)因感染鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)而大量死亡，用多種抗生素治療無(wú)效，這一發(fā)現(xiàn)使動(dòng)物源性不動(dòng)桿菌令人矚目[4]。近年來(lái)，該菌在水生動(dòng)物和畜禽感染上已有較多報(bào)道，如魚類感染廈門不動(dòng)桿菌(Acinetobacterxiamen)爆發(fā)性死亡[5]、龜類感染鮑曼不動(dòng)桿菌死亡[6]、鴨感染沃氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)死亡[7]、山羊感染鮑曼不動(dòng)桿菌死亡[8]等；此外，也有報(bào)道大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)感染醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)后急性死亡[9]、梅花鹿(Cervusnippon)感染不動(dòng)桿菌連續(xù)死亡[10]等。

2018年江西省某動(dòng)物園突發(fā)數(shù)羽白額雁(Anseralbifrons)死亡病例，筆者從患病白額雁的臟器中僅分離到1株細(xì)菌，經(jīng)純化、染色鏡檢、16S rDNA基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析，從分子水平上確定其為約翰遜不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)。同時(shí)進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選出相對(duì)敏感藥物進(jìn)行防治，取得了較好的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料來(lái)源

江西省某動(dòng)物園送檢白額雁的肝臟、肺臟病料。

1.2 主要試劑和儀器

血瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；小牛血清，購(gòu)自杭州江濱生物技術(shù)有限公司；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙錠(EB)、Tris堿、SDS等，購(gòu)自Solarbio公司；瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；omega DNA回收試劑盒，購(gòu)自華大基因公司。

1.3 主要儀器

SW-CJ型凈化工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸氣滅菌器、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5415R型冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf公司；K960型PCR儀，購(gòu)自杭州晶格儀器有限公司。

1.4 細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增通用引物

16S(F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S(R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，由華大基因公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取白額雁肝臟、肺臟病料于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用酒精棉球?qū)ζ浔砻孢M(jìn)行消毒滅菌，將無(wú)菌接種環(huán)插入肝臟及肺臟內(nèi)鉤取3—4次，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行涂片及純化，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，將純化細(xì)菌轉(zhuǎn)接菌種管保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定

2.2.1 細(xì)菌DNA模板提取

取蒸餾水100 μL加2接種環(huán)單個(gè)菌落于EP管混勻，煮沸10—15 min；12 000 rpm離心7 min，取上清，作為細(xì)菌DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列分析

PCR反應(yīng)體系：16S(F)、16S(R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序所得基因序列在NCBI上通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性檢索，將GenBank中收錄的同源性較高的同屬不同種菌株通過(guò)DNAStar進(jìn)行核苷酸同源性分析，并選取同科不同屬菌株用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法，將分離菌株接種血清肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)6—8 h，調(diào)整菌液濃度為1.5×108cfu/mL為藥敏試驗(yàn)用菌液。將菌液均勻涂布于TSA平板，將藥敏紙片貼于涂有菌液的TSA平板上，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌分離物在血瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、光滑、灰白色、邊緣整齊的小菌落。經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性球桿菌，單個(gè)散在排列(圖1)。

圖1 細(xì)菌鏡檢結(jié)果(G’s染色，10×100)Fig.1 Bacterioscopy results(G’s staining，10×100)

3.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定結(jié)果

分離株16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，如預(yù)期獲得大小約為1 500 bp產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果分離株基因片段長(zhǎng)度為1 367 bp，與NCBI基因庫(kù)BLAST中約翰遜不動(dòng)桿菌16S rDNA基因序列同源性達(dá)99.85%；分離株與約翰遜不動(dòng)桿菌核苷酸相似性最高達(dá)99.9%(圖3)，證實(shí)該分離株為約翰遜不動(dòng)桿菌，將其命名為AJ-JX01。

圖2 細(xì)菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of bacterial 16S rDNA gene 注：1為細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果；M為100 bp Labber DNA Note：1 is the result of bacterial 16S rDNA amplification，M is 100 bp Labber DNA

圖3 分離株16S rDNA基因序列的同源性分析Fig.3 Homology analysis of the 16S rDNA gene sequence of the isolate

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖4)，顯示菌株AJ-JX01與約翰遜不動(dòng)桿菌屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近，與波氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbouvetii)的親緣關(guān)系較近，而與信氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterschindleri)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，尤其與常見的鮑曼不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。莫拉氏菌屬(Moraxella)屬于另一分支，但與菌株AJ-JX01的親緣性較高。

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離株AJ-JX01對(duì)丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星敏感，對(duì)阿莫西林、頭孢哌酮、卡那霉素、妥布霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明中度敏感，對(duì)青霉素、林可霉素和桿菌肽耐藥(表1)。

4 小結(jié)與討論

4.1 不動(dòng)桿菌是由荷蘭微生物學(xué)家Beijerinck于1911年首次發(fā)現(xiàn)，到目前為止該菌屬已發(fā)現(xiàn)31個(gè)基因種，被命名的有17種[11]。本試驗(yàn)從動(dòng)物園白額雁的肝臟分離到1株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)學(xué)、細(xì)菌16S rDNA基因序列分析證實(shí)該菌為約翰遜不動(dòng)桿菌。

圖4 分離株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the 16S rDNA gene sequence of the isolate 參考菌株：約翰遜不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii)，波氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter bouvetii)，信氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter schindleri)，溶血不動(dòng)桿菌(Acinetobacter haemolyticus)，滕氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter tjernbergiae)，坦氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter tandoii)，沃氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter lwoffii)，抗輻射不動(dòng)桿菌(Acinetobacter radioresistens)，瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii)，鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)，奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella osloensis)，林氏莫拉氏菌(Moraxella lincolnii)，延髓莫拉氏菌(Moraxella oblonga)，腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)，牛摩拉菌(Moraxella bovis)

表1 分離菌株AJ-JX01藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

4.2 16S rDNA基因?yàn)榧?xì)菌的高度保守基因，具有細(xì)菌種、屬特異性。目前，16S rDNA序列分析技術(shù)已成為鑒定細(xì)菌種屬及分類的標(biāo)準(zhǔn)方法[12]。本試驗(yàn)運(yùn)用DNAstar軟件對(duì)分離株AJ-JX01與參考菌株16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，分離株AJ-JX01與約翰遜不動(dòng)桿菌核苷酸相似性高達(dá)99.6%以上，最高達(dá)99.9%，說(shuō)明分離株AJ-JX01為A.johnsonii。分離株與不動(dòng)桿菌屬其他菌株的同源性達(dá)96.3%—99.0%，結(jié)果表明約翰遜不動(dòng)桿菌16S rDNA序列呈現(xiàn)較高的保守性和穩(wěn)定性，差異較小；而分離株AJ-JX01與波氏不動(dòng)桿菌的核苷酸同源性高達(dá)99.0%，說(shuō)明其與A.bouvetii的差異性不大。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示分離株AJ-JX01與A.johnsonii屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近，而與信氏不動(dòng)桿菌、溶血性不動(dòng)桿菌(A.haemolyticus)、滕氏不動(dòng)桿菌(A.tjernbergiae)、坦氏不動(dòng)桿菌(A.tandoii)、沃氏不動(dòng)桿菌、抗輻射不動(dòng)桿菌(A.radioresistens)、瓊氏不動(dòng)桿菌(A.junii)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，尤其與常見的鮑曼不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明該菌的16S rDNA基因高度保守，具有種屬特異性。

雖然該菌為機(jī)會(huì)致病菌，在自然界廣泛存在，但近年來(lái)由其引起的各種動(dòng)物的感染不斷出現(xiàn)[5-10]。本次試驗(yàn)從死亡白額雁內(nèi)臟中僅分離到約翰遜不動(dòng)桿菌，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果該分離株對(duì)丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星等大部分的抗生素均較敏感，僅對(duì)青霉素、林可霉素和桿菌肽耐藥，臨床用藥仍取得較好效果，說(shuō)明該分離株耐藥性并不強(qiáng)，但出現(xiàn)在死亡白額雁內(nèi)臟仍值得關(guān)注。