酒泉市狐貍消化道蛔蟲分子鑒定及cox1基因序列分析

張建明

(酒泉職業技術學院，酒泉，735000)

生活水平提高使得消費者對裘皮的需求量逐漸增大，狐貍皮毛因其絨毛細柔、保暖性好而備受消費者青睞，且狐貍肉風味獨特，藥用與食用價值高，使得我國狐貍養殖業發展較為迅速，同時相關產業給養殖戶帶來了豐厚的利潤。由于部分養殖戶對狐貍生活習性不熟悉，且飼養環境較差，導致狐貍在養殖過程中容易感染寄生蟲病，寄生蟲病為消耗性疾病，可影響狐貍的肉質和毛皮質量，繼而造成巨大的經濟損失[1]。狐貍腸道寄生蟲病較為常見，王安等[2]對在呼倫貝爾草原野生狐貍腸道內分離到犬復殖孔絳蟲(Dipylidiumcaninum)、多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)、犬鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)、獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)等多達12種腸道蠕蟲。犬腸道蛔蟲可分為犬弓首蛔蟲(Toxascariscanis)和獅弓蛔蟲，其終末宿主均為犬、貓和狐貍等動物，其中獅弓蛔蟲生活史較為簡單，犬攝入感染性卵囊后，幼蟲可在犬腸道發育為成蟲，導致宿主消瘦、消化不良、毛皮質量下降等，嚴重導致死亡，同時對公共健康造成巨大威脅[3-4]。對于獅弓蛔蟲相關報道主要見于犬、貓等常見犬科(Canidae)動物，但對狐貍源獅弓蛔蟲的報道較少。本研究從酒泉市某北極狐(Alopexlagopus)養殖場狐貍腸道內分離到6條蛔蟲，通過對蟲卵及成蟲的形態學和分子生物學技術對蟲株進行鑒定，最終確定為獅弓蛔蟲病感染，本次研究為狐貍獅弓蛔蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與主要試劑

6個蛔蟲分離株分離于酒泉市某北極狐養殖場自然死亡的狐貍小腸內(3只)，根據蛔蟲分離株的形態特征可初步鑒定為蛔蟲，將其分別命名為JQ01—JQ06。將蟲株分別保存于70%酒精中，用于形態學和分子鑒定。DNA提取試劑盒 Promega公司；蛋白酶K購于Merck公司；PCR相關試劑購于北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程技術有限公司合成。

1.2 形態學鑒定

形態學鑒定步驟參考文獻[5]，將標本放置于光學顯微鏡進行觀察，參考相關文獻[6]根據頭部和尾部對蟲種進行形態學鑒定；采用飽和鹽水漂浮法對糞便樣品進行處理，顯微鏡下觀察蟲卵形態，根據蟲卵形態學特征進行初步鑒定[6]。

1.3 蟲種DNA提取與cox1基因序列擴增

參考DNA提取試劑盒對蟲體基因組進行提取，以基因組DNA為模板，采用文獻[7]中引物對蟲體線粒體細胞色素I(cox1)基因部分序列進行擴增，其中上游引物(cox1-F)：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物(cox1-R)：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAATG-3′PCR體系(50 μL)：PCR easy mix 25 μL、上下游引物(10 pmol)各2 μL、DNA模板3 μL、雙蒸水18 μL，混勻后低速離心5 s，同時設置陰性對照和陽性對照，其模板分別為雙蒸水和實驗室保存的犬獅弓蛔蟲DNA樣品；擴增條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環；最后72 ℃5 min。PCR產物經過凝膠電泳檢測，預期片段大小為420 bp左右。

1.4 cox1基因序列測序與分析

將PCR陽性產物進行純化后送至上海生物工程技術有限公司雙向測序，從GenBank中下載具有代表性蛔蟲cox1基因序列，應用DNAstar軟件對核苷酸序列同源性進行分析，以MEGA 5.0軟件分析序列的堿基比例，同時構建系統種系發育樹。

2 結果

2.1 形態學鑒定結果

對蟲卵特征進行觀察，該蟲卵為橢圓形，外有光滑的殼，符合獅弓蛔蟲蟲卵特征[8]，故也將從病死狐貍腸道分離蛔蟲分離株初步判定為獅弓蛔蟲(圖1)。

圖1 獅弓蛔蟲蟲卵(左圖)及成蟲分離株(右圖)形態學觀察Fig.1 Morphological observation of egg(left)and adult isolates(right)of Toxascaris leonina

2.2 cox1基因序列PCR擴增結果

本次研究對6個狐貍源蛔蟲分離株的線粒體cox1基因部分序列進行擴增，凝膠電泳圖結果如圖2所示，6個樣品均擴增出約420 bp的條帶，與預期大小基本一致，陰性對照無條帶。

2.3 蛔蟲cox1基因序列分析

測序結果顯示，本次研究獲得的6個蛔蟲cox1基因序列大小一致，為418 bp，其A、T、C、G堿基所占平均比例分別為17.82%、44.50%、11.14%和26.49%，序列表現出明顯的AT堿基富集(62.38%)。6個蟲株的cox1基因序列同源性為99.4%—100.0%，與已知獅弓蛔蟲分離株(KC293944.1、KC293932.1)同源性為99.4%—99.7%，與犬弓首蛔蟲(KC2939 03.1、KC293913.1)、貍貓弓蛔蟲(Toxocaratanuki)(AB446546.1)、豬蛔蟲(Ascarissuum)(AB591805.1)和人蛔蟲(Ascarislumbricoides)(AB591798.1)相應基因序列同源性為86.2%—91.9%。序列同源性分析結果表明6個狐貍源蛔蟲分離株與獅弓蛔蟲同源性最高(圖3)，將其基因序列提交至GenBank收錄，其序列號為(MK591006.1-MK591011.1)。

圖2 狐貍源蛔蟲線粒體cox1基因序列擴增凝膠電泳圖Fig.2 Analysis of amplification of mitochondrial cox1 gene sequences from foxy roundworm 注：M：DL2000 marker；P：陽性對照；N：陰性對照；1—6：檢測樣品 Note：M，DL2000 marker.P，positive sample.N，negative sample.1-6，six tested specimens

圖3 狐貍源蛔蟲與其他蛔蟲cox1基因序列同源性比較結果Fig.3 Analysis of homology comparison of cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

2.4 cox1基因序列系統進化分析

為了進一步分析本研究獲得的6株狐貍源蛔蟲分離株與其他已知蛔蟲的種系發育關系，以貍貓弓蛔蟲(AB446546.1)為外群，應用MEGA 5.0軟件中NJ法構建系統種系發育樹。結果如圖4所示，6個蛔蟲分離株與已知不同宿主源獅弓蛔蟲(KC293944.1、AJ920064.1、MH795159.1和KC293932.1)所屬分支聚為同一支，與豬蛔蟲(AB591805.1)和人蛔蟲(AB591798.1)相距較近，與犬弓首蛔蟲所屬分支相距較遠。結合形態學鑒定結果，可將本次研究獲得的6個狐貍源蛔蟲鑒定為獅弓蛔蟲。

圖4 基于cox1基因序列構建狐貍源蛔蟲與其他蛔蟲的種系發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

3 討論

蛔蟲病是常見的寄生蟲病，主要寄生于宿主小腸內，導致宿主生長緩慢、免疫力下降、腸道堵塞等，常繼發其他感染性疾病，甚至導致宿主死亡[9-10]。獅弓蛔蟲屬于蛔目(Ascaridida)，蛔科(Ascarididae)，弓蛔屬，可感染犬科、貓科(Felidae)等多種哺乳動物，掠奪宿主營養物質，引發胃腸炎、腸道堵塞等臨床癥狀，同時感染獅弓蛔蟲的宿主可隨糞便排出感染性蟲卵，感染性蟲卵污染水源、飼料或土壤后，其他宿主接觸或吞食含感染性蟲卵的土壤或食物可感染該病。

由于寄生蟲形態學特征(特別是形態學相近的蟲種)易受地理環境的影響，對寄生蟲進行形態學鑒定有一定的局限性[11]，以PCR技術為代表的分子生物學技術已經廣泛應用于寄生蟲的蟲種鑒定，其中線粒體cox1基因廣泛用于寄生蟲的分子鑒定和種系遺傳學研究[12-14]。目前，關于狐貍源蛔蟲的分子鑒定與遺傳變異研究較少。在形態學鑒定的基礎上，本次研究通過對狐貍源蛔蟲cox1基因進行PCR擴增與分析，結果確定本次研究分離的6株狐貍源蛔蟲均為獅弓蛔蟲，其結果印證前期研究[2]，序列分析結果顯示，狐貍源獅弓蛔蟲cox1基因序列較為保守，種內遺傳差異為0—0.6%，低于獵豹(Acinonyxjubatus)獅弓蛔蟲cox1基因序列種內差異(1.4%—6.8%)[14]，提示在進化過程中，不同種屬獅弓蛔蟲cox1基因序列變異情況有所差異，同時狐貍源獅弓蛔蟲cox1序列與其他蛔蟲同源性為8.1%—13.8%，種內遺傳差異遠低于種間變異，提示cox1序列可作為狐貍源獅弓蛔蟲分子鑒定標記，同時提示該養殖場需加強對狐貍的飼養管理水平，定期做好驅蟲工作。