一例雉科鳥類跨屬雜交及其親本物種的鑒定

杜焓瑜 匡高翔 馬 躍 葉永紅 李 榮 李廣龍 徐艷春，5*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.重慶動物園，重慶，400050；3.國家林業和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；4.國家林業和草原局林產工業規劃設計院，北京，100010；5.國家林業和草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040)

自然條件下近緣種之間的雜交較為普遍，據統計，16.4%的鳥類有雜交現象[1]，近20%的雞形目(Galliformes)鳥類可種間雜交[2]。雜交是打破物種界限的去分化過程，一方面可提高物種的遺傳多樣性和個體雜合度，減少有害基因的效應，促進適應性基因的水平傳播，產生新的適應性性狀，甚至可形成新的種化進程[3-4]，但另一方面雜交也可能促進有害基因的跨種傳播，帶來繁殖障礙和遠交衰退，造成個體不育和后代死亡，降低遺傳多樣性[5-6]。研究表明，在人工飼養條件下物種間雜交會變得更加容易，約21.1%的物種都可雜交[1]，如白腹錦雞(Chrysolophusamherstiae)和紅腹錦雞(C.pictus)、藍孔雀(Pavocristatus)和綠孔雀(P.muticus)[7-8]，甚至還可能發生跨屬雜交[9-10]，如紅腹錦雞和白冠長尾雉(Syrmaticusreevesii)[11]。動物園是人工飼養野生動物的場所，保存生物多樣性是其核心使命之一[12]。因為雜交存在明顯的雙面效應，雜交后代的保護價值存在很多爭議，通過種間雜交來達到保護的目的需慎重考慮，甚至不被提倡[3，13]。

雉科(Phasianidae)是雞形目鳥類中最大的一科，中國雉科鳥類包括的屬種約占世界的三分之一[11]。許多雉科鳥類由于羽衣華麗，姿態優美，頗受人們的喜愛；此外雞形目鳥類適應性強，對籠舍環境和飼料要求低，飼養管理相對簡單[14-15]，是動物園展覽的重要鳥類。近年來，越來越多的動物園開始采用大籠舍、大空間、高度豐容的環境進行多物種混合飼養和展出，形成了“鳥語林”“雉雞苑”“百雞園”“百鳥園”等具有品牌特色的展示方式。但混合展示同時也給遺傳管理帶來難度，不僅種內的婚配難以控制，而且還經常發生跨種交配。產生的雜交后代在外部形態上有時有著明顯的雙親特征，如特殊羽毛類型、花紋樣式等。但在親本物種比較相似的情況下，或者經過多代雜交、回交后，雜交個體或其親本物種則常常無法確證，從而妨礙對其后代的管理。因而，除了形態學方法之外，需要建立更加準確的雜交個體親本的鑒定方法。

2019年，重慶動物園混合飼養的雞形目鳥類中，發現1只自然交配繁殖的雜交個體(圖1)，據飼養繁殖記錄顯示，其2018年5月出殼，現已為成體。從其形態特征上初步推測親本可能為環頸雉(Phasianuscolchicus)、藍孔雀或貴妃雞(Gallusgallusdomesticus)。本研究以此案例為對象，利用其形態學特征、線粒體基因和微衛星遺傳標記建立一套鑒別雜交個體親本的方法，為動物園散養模式下鳥類種群的遺傳管理提供借鑒。

圖1 飼養條件下雞形目鳥類自然交配產生的雜交個體Fig.1 The hybrid phasianid produced by natural mating in captivity

1 材料與方法

1.1 形態學測量方法

本實驗形態學測量樣本均來自重慶動物園未知雜交個體的飼養籠舍，所選個體均為成體，其中貴妃雞12只(6♂、6♀)、藍孔雀12只(6♂、6♀)、環頸雉6只(3♂、3♀)、待鑒定雜交個體1只。

鳥類捕捉后，按照規程保定[16]，用卡尺和卷尺測量記錄9個形態學參數：體長(自喙尖到尾羽基部的長度)；尾長(自尾羽基部至末端的直線距離)；翅長(自翼角至翼尖的直線距離)；喙長(即嘴峰長，自喙基與羽毛的交界處至上喙喙尖的直線距離)；口裂長(自嘴峰到口裂后緣的直線距離)；跗蹠長(脛跗骨與跗蹠骨之間的關節處至跗蹠骨與中間趾的關節處的距離)；跗蹠前部鱗片數(自跗蹠基部到踝關節前面方形鱗片的數量)；趾長(自爪基部到趾基部的直線距離)；爪長(自爪端部到爪基部的直線距離)；精確到mm。

1.2 分子遺傳學鑒定

1.2.1 樣品采集

從未知親本雜交個體，6只貴妃雞和11只藍孔雀的胸部拔取廓羽1枚，分別編號為HY01、GF01—06和BP01—11，置于牛皮紙信封中，自然干燥，常溫保存備用。后期為鑒定其核基因來源又采集藍孔雀樣本11只。本實驗所有樣品皆為羽毛樣本。

1.2.2 DNA的提取

用滅菌的解剖剪剪取羽毛基部2 mm，置于1.5 mL離心管中剪碎，加入20 μL 1 mol/L DTT，295 μL TNE緩沖液(pH=8.0)，35 μL 10% SDS溶液，20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)56 ℃恒溫消化過夜，直至羽根完全溶解。然后利用基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取DNA。使用Nanodrop 2000c(Thermo Scientific，USA)核酸濃度測定儀測定所得DNA溶液的濃度，按照濃度將所有DNA樣品稀釋至20 ng/μL，置于-20 ℃保存備用。

1.2.3 性別鑒定

使用鳥類性別鑒定CHD基因通用引物 sex1′(5′-CTCCCAAGGATGAGAAACTGTGCAAAACAG-3′)和sex-mix(5′-CCTTCGCTGCCATTGAAGCTAATCTGGAAT-3′)[17]，以已知雄性、雌性的貴妃雞作為陽性對照，對雜交個體HY01進行性別鑒定。PCR反應在10 μL體系中進行，包括正反向引物各0.2 μL(10 μmol/L)、2×EasyTaq?PCR SuperMix(Transgen，北京)5 μL、ddH2O 1.6 μL、模板DNA 3 μL。擴增采用PE9700型DNA擴增儀(PE，美國)，反應程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，擴增35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用2.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離(80 V穩壓，1 h)，以DL1000 marker(Takara，大連)為分子量標準估算擴增產物的大小，用凝膠成像儀拍照并記錄實驗結果。

1.2.4Cytb序列的PCR擴增及測序

使用鳥類Cytb基因的通用引物Mcb398(5′-TACCATGAGGACAAATATCATTCTG-3′)和Mcb869(5′-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-3′)[18]擴增雜交個體和貴妃雞的相應片段。PCR反應體積為50 μL，含有2×EasyTaq?PCR SuperMix緩沖液25 μL，正反向引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA(20 ng/μL)3 μL，用滅菌后的超純水補足體積。反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環，最后72 ℃延伸7 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離(80 V 穩壓，40 min)，目的條帶用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit試劑盒進行純化回收，用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 進行Sanger法測序，測序由上海生工生物有限公司完成。同時從GenBank 中下載30條環頸雉和8條藍孔雀的細胞色素b序列(Cytb)進行比較分析(圖5)。

1.2.5 微衛星擴增及分型

從Hale等[19]和包文斌等[20]報道的位點中挑選能夠用于雞形目的微衛星位點及引物，經過實驗驗證，獲得能夠穩定擴增藍孔雀和貴妃雞的微衛星引物15對(表1)，其中每對引物的上游引物的5′端進行FAM(藍色)、JOE(綠色)、TAMRA(黑色)3種熒光標記。擴增后對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將成功擴增的產物送至上海生工生物科技有限公司，利用ABI3130遺傳分析儀進行毛細管電泳，最終獲得各位點基因分型數據。PCR 反應總體積為15 μL，其中：模板DNA(20 ng/μL)1.5 μL，TransStart?TopTaqDNA聚合酶0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，10 × TransStart?TopTaqbuffer 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，用滅菌后的超純水補足體積。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度Ta見表1)，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環，最后72 ℃延伸10 min。

表1 15個微衛星位點的引物序列及其退火溫度

續表1

1.3 數據分析

1.3.1 形態學聚類分析

在數據分析前，用體長對尾長、翼長、喙長、口裂長、跗蹠長、四爪總長、四趾總長7個形態參數進行標準化來消除年齡及體型的影響，將7項參數與體長的比值作為最終分析指標。用跗蹠長對跗蹠前部鱗片數量進行標準化，得到跗蹠鱗片密度。標準化后得到8項形態學指標，用OriginPro 2018(OriginLab Corporation，USA)作箱形圖直觀展示疑似親本和雜交個體之間的差異。利用SPSS 19.0對8項指標進行主成分分析，并利用歐式距離法(Euclidean distance)進行聚類分析。

1.3.2 分子生物學數據分析

將測得每條序列用DNAStar[21]軟件包中的SeqMan進行校對，在Clustal W上將所有的序列進行比對，利用MEGA 5.05軟件[22]基于Ts計算兩兩個體之間的Kimuar-2-parameter遺傳距離，采用 neighbor-joining(NJ)法構建系統發育樹，置信度為1 000次自舉法檢測，并計算未知雜交個體與環頸雉、藍孔雀和貴妃雞群體間的遺傳距離，確定其母本信息。利用GENETIX 4.05軟件對推測父本與等位基因之間的對應關系進行了因子對應(FCA)分析，驗證遺傳標記的有效性。利用Population 1.2.32軟件基于Nei氏遺傳距離構建NJ系統發育樹，計算未知雜交個體分別與藍孔雀、貴妃雞的遺傳距離。

2 結果

2.1 性別鑒定

利用性別鑒定引物sex1′/sex-mix對已知性別的貴妃雞和雜交個體均成功擴增，其中已知雄性(1號泳道)得到1個297 bp的條帶，已知雌性(2號泳道)得到257 bp和297 bp的2個條帶。雜交個體(3號泳道)得到1條297 bp的條帶，判定為雄性(圖2)。

2.2 形態學指標聚類分析

形態指標比較結果顯示，雜交個體的相對尾長與3種鳥的均值的差異分別為0.098 mm、-0.022 mm、-0.018 mm；相對翼長的差異分別為0.051 mm、0.079 mm、0.037 mm；相對喙長的差異分別為0.015 mm、-0.030 mm、-0.005 mm；口裂長的差異分別為0.003 mm、-0.025 mm、0 mm；跗蹠長的差異分別為-0.018 mm、-0.027 mm、0.023 mm。跗蹠鱗片密度的差異分別為0.010 mm、-0.060 mm、0.009 mm；四爪長的差異分別-0.026 mm、-0.027 mm、0.014 mm；相對四趾長的差異分別為-0.061 mm、-0.108 mm、0.021 mm(表2)。雜交個體在以上形態指標上更加接近于環頸雉和貴妃雞，而與藍孔雀較遠(圖3)，說明雙親很可能為環頸雉和貴妃雞。

圖2 通過引物sex1′/sex-mix對雜交個體進行性別鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophorogram of PCR products for sex determination of hybrid bird using the primer pair sex′/sex-mix 注：1、2號泳道分別為已知雄性♂、已知雌性♀的陽性對照；4號泳道為陰性對照(ddH2O)；3號泳道為雜交個體；M為DL1000 Marker(片段分別為1 000 bp、700 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp) Note：Lane 1 and 2 are positive controls of known male，known female.Lane 4 is negative control(ddH2O).Lane 3 is the hybrid bird.M is DL1000 DNA fragment size ruler(1 000 bp，700 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp)

表2 雜交個體和雄性貴妃雞、環頸雉和藍孔雀群體均值的差異

主成分分析的前兩個主成分累計貢獻率為99.637%，其中第一主成分貢獻率為94.360%，尾長/體長等8項指標在第一主成分上都具有很高載荷(大于0.9)，說明8項指標均具有很好的解釋形態差異的能力。雜交個體與貴妃雞的歐式距離最小，為0.119，與環頸雉的距離為0.131，與藍孔雀的距離最大，為0.742(表3)。4組個體被聚為兩大分支，第一支包含貴妃雞、雜交個體和環頸雉，第二支只有藍孔雀(圖4)。結果進一步說明雜交個體與藍孔雀的關系較遠，而與貴妃雞和環頸雉的關系較近。

2.3 母系鑒定結果

實驗測得的Cytb基因片段大小為421 bp。以雜交個體與環頸雉(n=30)、藍孔雀(n=8)和貴妃雞(n=6)共45個個體的Cytb序列計算遺傳距離，結果顯示，雜交個體與環頸雉、貴妃雞和藍孔雀群體的遺傳距離分別為(0.007±0.003)、(0.107±0.018)和(0.097±0.017)，其與環頸雉群體的遺傳距離較貴妃雞和綠孔雀低1—2個數量級。NJ 系統樹(圖5)更加清晰地顯示，所有個體分為兩大分支，第一個分支包含所有的環頸雉序列。環頸雉序列進一步分為兩個分支，而雜交個體屬于第二個分支，bootstrap支持度為100%。第二個分支包括貴妃雞和綠孔雀，二者又分數兩個不同的分支，bootstrap支持度也達到100%。綜合以上結果，可以認定雜交個體的母本為環頸雉。

圖3 雜交個體和3種疑似親本的8項形態學指標的分布Fig.3 Distribution of eight morphometric indices of the hybrid and three suspect paternal species

表3 雜交個體和雄性貴妃雞、環頸雉和藍孔雀群體間的歐式距離

圖4 雜交個體和雄性貴妃雞、藍孔雀、環頸雉群體的聚類分析Fig.4 Clustering analysis of the hybrid and male royal chicken(Gallus gallus domesticus)，ring-necked pheasant(Phasianus colchicus)and blue peafowl(Pavo cristatus)

圖5 基于Cyt b基因構建的雜交個體、環頸雉、貴妃雞和藍孔雀的NJ系統樹Fig.5 Neighbor Joining tree of the hybrid bird，ring-necked pheasant，royal chicken and blue peafowl based on Cyt b sequences 注：★示雜交個體；分支上的數字為 bootstrap 值(低于50%的數值沒有顯示) Note：Sequence data of ring-necked pheasant and blue peafowl were downloaded from GenBank.Accession numbers are shown next to the branch.The hybrid bird is indicated using ★.Bootstrap values(>50% only)are shown next to corresponding nodes

2.4 核基因鑒定

2.4.1 微衛星標記有效性檢驗

用15個微衛星位點對貴妃雞和藍孔雀2個疑似父本的群體進行基因分型。對2個群體個體間遺傳差異進行因子相關分析(FCA)，結果顯示，最主要的2個影響因子共體現了46.67%的遺傳差異，11只藍孔雀被分為2個亞群，可能與不同的祖先來源有關。而貴妃雞和藍孔雀群體顯著分開(圖6)，表明根據15個微衛星位點的遺傳信息能夠可靠地分辯開貴妃雞和藍孔雀2個疑似父本物種，可用于該雜交個體父本的鑒定。

2.4.2 遺傳距離分析

利用Population 1.2.32軟件計算雜交個體、藍孔雀和貴妃雞的兩兩個體間的Nei氏遺傳距離，結果顯示雜交個體與貴妃雞的平均遺傳距離為0.166，與藍孔雀的平均遺傳距離為0.535。基于Nei氏遺傳距離構建的NJ樹進一步顯示(圖7)，貴妃雞和藍孔雀分別聚為兩大分支，且二者之間的距離較遠。雜交個體HY01的位置非常靠近貴妃雞，而遠離藍孔雀。根據以上結果可以判定，雜交個體HY01的父本為貴妃雞。

圖6 貴妃雞和藍孔雀15個微衛星基因型的FCA二維散點圖Fig.6 Scatter plot of factorial correspondence analysis(FCA)of royal chicken and blue peafowl based on 15 microsatellite genotypes

圖7 雜交個體、貴妃雞和藍孔雀群體的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of the hybrid bird，royal chicken and blue peafowl 注：該系統樹為基于兩兩個體間遺傳距離所構建的NJ樹，遺傳距離由15個微衛星位點的基因型數據計算而來，★示雜交個體 Note：This phylogenetic tree is the NJ tree constructed based on pairwise genetic distance estimated using 15 microsatellite genotypes.★ indicates the hybrid bird

3 討論

自然界中，種間生殖隔離主要依靠同種識別/異種不識別、精子免疫排斥、胚胎生命力低下和后代不育等生理機制[23]和繁殖周期差異化、生態位分離等生態機制[24-26]來實現。但在人工飼養條件下，空間隔離被打破，食物充分供應，管理周期一致，使其繁殖周期趨于一致，就有機會打破種間隔離而產生雜交[27]。現今的動物園在展示方式、豐容、管理等方面的能力不斷提高[28]，導致圈養物種間比以往任何時候都更可能產生種間雜交。

雜交個體的親本物種可依據雜交個體所具有的親本形態特征做出判斷。但如果后代可以，并與親本物種進行回交，則表型上會逐步靠近回交親本，直至難以辨別，最為典型的是綠孔雀×藍孔雀的雜交。近年來，學者們發現利用分子生物學方法能夠鑒定形態上無表現的雜交種，DNA分子標記的廣泛應用為鑒定雜交個體及其親本物種提供了有效的手段[29-30]，但實際管理中需一套鑒定流程來解決此類問題。

本案例中的雜交個體具有典型性，首先，是多個物種共同散養在一個環境中，管理方式相同，有機會通過自然交配產生后代。與大多數雜交不同，本例屬于跨屬的遠緣雜交，發生幾率和后代成活幾率更低，親本鑒定相對容易。因此，本研究先從形態學角度解決這一問題。鑒于雞形目物種普遍具有二型性，首先對其進行了性別鑒定，根據性別，與同性別親本物種進行比較。結果顯示，體長、尾長、翅長、喙長、口裂長、跗蹠長、爪長和趾長等常規量度都可準確地鑒定2個親本的物種。通過歐幾里得距離進行聚類，可直觀地顯示雜交個體與疑似親本物種的關系，進而做出認定和排除的結論。該方法雖簡單、易行，幾乎不需要分析成本，但也存在局限性：第一，必須清楚雜交個體的性別；第二，不能把親本物種具體明確到父本或母本；第三，測量活體時需要捕捉和保定動物，造成應激，對于高度敏感的物種應該慎用。

DNA鑒定親本主要依據物種鑒定的原理。首先通過線粒體DNA(mtDNA)的序列分析，鑒別出母本物種，然后再通過核基因的分析鑒別父本物種。本案例中首先采用Cytb基因的序列確定了其母系物種為環頸雉，然后從疑似父本的物種中排除環頸雉，減少父本鑒定的工作量和成本。本實驗采用15個微衛星位點，通過計算雜交個體分別與疑似父本貴妃雞和藍孔雀的遺傳距離，確定了其父本物種為貴妃雞。

相比形態學方法，DNA鑒定方法的優勢在于其非損傷性采樣避免應激反應，并且結果有更高的可靠性。線粒體存在于細胞質中，受精過程中，精子把細胞核注入卵子的過程中，要么細胞質連同線粒體被留在外面，要么注入卵子后通過被降解，使合子乃至胚胎的mtDNA僅來源于卵子，故此mtNDA遵從母系遺傳[31]。mtDNA上的Cytb基因的進化速率與物種分化速率大體相同，是最為靈敏可靠的物種鑒定分子標記[32-33]。父本物種的鑒別比母本復雜得多。鳥類W染色體為雌性所特有，雌鳥的性染色體核型為ZW型，雄鳥為ZZ型。故此沒有父本專屬的染色體，無法通過mtDNA這樣的遺傳標記鑒別父本物種。微衛星是共顯性遺傳標記，分辨率高，可以顯示雙親的遺傳信息，因而在雜交個體鑒定中比較常用[34-35]。微衛星側翼序列在近緣種之間具有保守性，可以設計近緣種通用引物進行PCR擴增和分型[36]。但通用性并不完全，在不同物種之間互用時，會出現一定頻率的等位基因丟失、無效等位基因等問題，甚至擴增失敗[37]，影響鑒定的可靠性。本研究中的微衛星位點均經過對3個物種的有效性驗證(另文發表)。因此，尋找合適的微衛星位點用于物種間的擴增鑒定將是今后解決此類雜交問題不可避免的工作。

總之，今后對于雉科鳥類雜交親本的物種鑒定，可根據需要，選擇形態學方法或分子生物學方法，也可以二者結合，提高鑒定的可靠性。