白冠長尾雉源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與敏感抗菌藥物的篩選

王光鋒 李 舫

(山東畜牧獸醫職業學院，濰坊，261061)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌代表，大部分金黃色葡萄球菌可產生腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)、殺白細胞素和剝脫毒素等毒性蛋白[1]，進而引起食物中毒、蜂窩織炎、腸炎、敗血癥、過敏性疾病及自身免疫性疾病等[2]，還可以引起雞、鴨、鵝、豬、牛、兔等多種家禽、家畜發病。家禽感染主要表現為關節炎、腱鞘炎、腳墊腫、臍炎和葡萄球菌性敗血癥[3-4]等。該菌在自然界分布廣泛，一年四季均可發生，為臨床重要的人獸共患病病原菌。

白冠長尾雉(Syrmaticusreevesii)屬于雞形目(Galliformes)，雉科(Phasianidae)，是中國特產珍禽，屬國家Ⅱ級保護動物。目前，國內關于白冠長尾雉的研究主要集中在種群數量調查、人工飼養繁殖、生理生化習性以及生態學等方面[5]，關于白冠長尾雉疾病防治的研究較少。2019年5月，山東濰坊某動物園的白冠長尾雉發生一種急性疾病，病雉食欲下降、精神沉郁、關節腫脹、跛行，眼瞼有膿性分泌物。剖檢可見肝臟腫大，有黃白色點狀壞死灶；脾臟腫大，呈紫紅色；關節有膠胨樣滲出物。本試驗從送檢白冠長尾雉病死病料中分離到1株細菌，通過細菌學檢驗方法鑒定為金黃色葡萄球菌，篩選了敏感藥物，為該病的防治提供了依據。

1 材料和方法

1.1 病料來源

無菌采集動物園病死白冠長尾雉的肝臟、關節滲出液等組織。

1.2 主要試劑

腦心浸出液(BHI)液體培養基、普通營養瓊脂、Baird-Parker瓊脂(BP)、革蘭氏染液購自青島海博生物技術有限公司；CM304凍干兔血漿購自北京陸橋技術有限責任公司；藥敏試紙片、微量生化發酵管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 細菌的分離與培養

將無菌采集的肝臟和關節滲出液病料，劃線接種于營養瓊脂上，37 ℃倒置培養18—24 h，觀察菌落形態，挑取單個優勢菌落，進行細菌的純化。取典型菌落接種鑒別培養基Baird-Parker瓊脂，37 ℃培養24 h，觀察細菌的生長特征。

1.4 細菌形態學鏡檢

將純化的細菌培養后，挑取單菌落，制備標本片進行革蘭氏染色，鏡檢觀察細菌形態。

1.5 細菌生化鑒定

將初步鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，接種于普通營養瓊脂37 ℃培養24 h，進行生化鑒定和血漿凝固酶試驗。血漿凝固酶的檢測采用兔血漿凝固法，操作方法如下：將分離菌接種至含BHI培養基的試管中37 ℃培養16 h，用生理鹽水將凍干兔血漿1∶4稀釋，取0.5 mL稀釋后的兔血漿加入小試管中，再加0.3 mL上述培養的細菌液，兩者混合均勻后置37 ℃恒溫培養箱內，每間隔0.5 h觀察1次結果。若6 h內小試管中兔血漿和細菌培養物出現凝固或凝固體積大于原體積的一半，則判定為血漿凝固酶陽性[6-7]。同時做已知樣品的陽性、陰性對照。

1.6 16S rRNA基因檢測

根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取分離菌的基因組DNA。采用已報道的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′，對分離菌株16S rRNA基因進行擴增，預期擴增DNA片段大小為1 504 bp。PCR反應用30 μL反應體系，制備好的細菌基因組DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×PCR Magic Mix 3.0 15 μL，滅菌水11 μL，瞬時離心混勻。反應參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s、55 ℃變性45 s、72 ℃延伸60 s，35個循環，最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果并將PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果在GenBank中進行BLAST分析。

1.7 致病性試驗

將20只健康成年雞(Gallusgallus)隨機分為2組，試驗組每只雞皮下接種1 mL培養至15 h的分離菌株肉湯培養物(用生理鹽水調到1×108cfu/mL)；對照組每只接種1 mL的生理鹽水。連續觀察7 d，每天記錄發病死亡情況，死亡雞剖檢并進行細菌的分離。

1.8 藥物敏感性試驗

取純培養的新鮮菌液接種平板，每個平板接種50 μL，用滅菌L棒均勻涂布，用無菌鑷子夾取各種抗菌藥物紙片貼在培養基表面，每個平板貼7張藥敏紙片，每張紙片間距不少于20 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，貼好后倒置于37 ℃溫箱培養24 h，觀察結果。

2 結 果

2.1 細菌分離培養鏡檢結果

病雉肝臟、關節滲出液病料接種營養瓊脂平板上均形成中等大小，表面光滑，邊緣整齊，初呈灰白色，繼而為金黃色不透明的菌落。在Baird-parker瓊脂上形成圓形、光滑濕潤、灰黑色的菌落，菌落周圍有一混濁帶，外層有一透明圈。鏡檢可見單個、成雙、短鏈或堆狀的藍紫色球狀細菌。

2.2 細菌生化試驗結果

結果表明分離菌株能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，甲基紅試驗陽性，V-P試驗陰性，還原硝酸鹽，不產生靛基質，H2S試驗陰性，可產生血漿凝固酶，與報道的金黃色葡萄球菌的生化特性一致[8]。

2.3 致病性試驗結果

實驗組接種細菌后24 h出現精神沉郁、食欲下降，接種部位皮膚破潰、關節腫脹，72 h 開始死亡，接種后7 d試驗雞發病率為100%(10/10)，死亡率為70%(7/10)。死亡雞剖檢病變主要為肝、脾出血，從病變組織分離到細菌，經鑒定為金黃色葡萄球菌。對照組無明顯癥狀。

2.4 PCR檢測結果

分離菌株基因組DNA利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，獲得大小約為1 500 bp的目的片段，與預期片段大小相符(圖1)。測序結果在GenBank進行Blast比對，與其同源性最高的均為金黃色葡萄球菌各株系的16S rRNA序列，同源性達到99.2%以上，進一步證實分離菌株為金黃色葡萄球菌。

圖1 分離菌株PCR鑒定Fig.1 PCR identification of the isolated strain 注：M：DNA標準DL2000；1：分離菌株的PCR擴增產物 Note：M，DNA ladder marker DL2000.1，PCR amplification product of isolated strain

2.5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，分離菌株對米諾環素、大觀霉素、萬古霉素、苯唑西林、哌拉西林、妥布霉素、頭孢類藥物等15種藥物敏感；對卡那霉素、氨芐西林、四環素、左氟沙星、鏈霉素、慶大霉素6種藥物中介；對青霉素、環丙沙星、氨曲南等11種藥物耐藥(表1)。

3 討 論

白冠長尾雉數量稀少，為全球性易危物種。為了保護這一物種，國內學者已經對其生態學、行為學等方面進行了深入研究[9]，但關于其疾病防治，目前只有白冠長尾雉感染雞異刺線蟲(Heterakisgallinae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等的報道[10-12]。本試驗從動物園發病的白冠長尾雉肝臟、關節滲出液病料中分離到1株細菌，經細菌分離培養、形態鏡檢、生化試驗、16S rRNA序列分析鑒定為金黃色葡萄球菌。通過致病性試驗，證實分離菌對健康成年雞有較強的致病作用，并從人工感染的雞體內再次分離到金黃色葡萄球菌，證實該動物園白冠長尾雉發病是由金黃色葡萄球菌感染所致，為國內首次報道。

金黃色葡萄球菌是多種動物的病原菌，該菌抗原結構復雜，可以通過產生水解酶(β-內酰胺酶)滅活抗生素，也可以通過改變藥物作用的靶位結構，降低抗生素的敏感性[13]。本文藥敏試驗結果顯示，分離菌株對米諾環素、大觀霉素、頭孢類藥物等15種藥物敏感；對卡那霉素、氨芐西林、四環素、左氟沙星、鏈霉素、慶大霉素6種藥物中介；對青霉素、環丙沙星、氨曲南等11種藥物耐藥，說明該分離株耐藥性已較嚴重。所以當動物發生該病時，應通過藥敏試驗選擇敏感有效的藥物，合理使用，以提高治療療效。

表1 分離菌株藥敏試驗結果

金黃色葡萄球菌對外界環境抵抗力較強，常因氣候突變、皮膚傷口感染、驅趕或注射疫苗等應激因素影響，引起動物發病。所以動物園要加強珍禽飼養區的管理，及時清理糞便、清潔用具，對飼養工具定期消毒，搞好環境衛生，以降低葡萄球菌病的發生。