毛干DNA提取中四種細菌清除方法的比較研究

周永恒 馬 躍，2 崔靚玉 徐艷春，2，3 楊淑慧*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.國家林業和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；3.國家林業和草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040)

毛發是一種最常見、易存儲、抗污染能力強的生物材料[1-2]，含有多態性蛋白質、激素和DNA等，可以提供動物個體的生物學信息[3-5]。其中DNA所能夠提供的遺傳信息最為豐富，不僅用于物種鑒定，還可用來推斷系統發育關系、分析種群遺傳結構、追溯個體間的血緣關系等[6-7]。但是這些信息的挖掘潛力受限于DNA的質和量，DNA質量越低實驗分析越困難。

毛發與其他組織一樣，具有核DNA(nuDNA)和線粒體DNA(mtDNA)。毛干形成后期主要是細胞的角化，這一過程伴隨著nuDNA的降解，除了角蛋白合成有關的基因以外，其他的部分逐漸斷裂、降解、消失[5]。最后存留的DNA片段很小，而且含量極低。mtDNA的拷貝數是nuDNA的數百倍，且處于細胞質的線粒體中，保存的機會較高[5]。因此，通常情況下，可以從毛干角化組織中獲得足夠的mtDNA用于PCR擴增[8]，而nuDNA則非常困難。雖然經過大量嘗試，對于nuDNA上遺傳標記的分析仍然達不到穩定、可靠，除了PCR擴增成功率低以外，還可能出現等位基因缺失和雜峰等問題[9-12]，因此，人們普遍認為毛干中提取的DNA不能用于核遺傳標記的分析。

我們前期研究中發現，造成這種情況的主要原因還是在于提取效率低下。我們改進了提取方法，從毛干中得到的DNA可用于微衛星等核基因的分析(另文報道)，但是無法用于基因組的測序。主要原因是毛干DNA中混有大量的細菌DNA，其數量遠遠超過動物DNA。這些細菌DNA主要來自毛發表面和經斷裂處進入髓質的環境細菌。只要有效去除細菌DNA，有效富集動物DNA，就可以在高通量測序中獲得足夠的動物序列。

去除細菌DNA可以有兩種途徑：一是把毛發在提取DNA之前徹底清洗，去除細菌；二是在獲得DNA之后，把細菌DNA分離出去。第二種途徑通常采用甲基化抗體包被的磁珠，特異性地吸附甲基化豐富的動物DNA，而不吸附甲基化缺乏的細菌DNA，從而達到分離目的。但是這一方法一方面費用十分昂貴，另一方面，操作過程涉及多次移液，會損失大量的動物DNA。因此，清除細菌是最為便捷、便宜的途徑。目前清洗毛發的方法有很多，一般常用的方法是用加酶洗衣粉溶液浸泡、沖洗毛發，然后以無菌水漂洗，再用70%—75%的酒精浸泡[13]。洗衣粉溶液也可以用日用洗發水溶液替代。但這些方法清除細菌不徹底，黏附于鱗片內側和進入毛干內部的細菌無法清除。

我們建立了一種清洗毛發的方法，能夠高效、快速地去除毛干上的細菌，且對下游DNA的提取影響不大。這種方法采用常規試劑和儀器，成本低廉，便于推廣應用。

1 材料與方法

1.1 毛發樣品及其預處理

實驗前將所有的剪刀、刀片、鑷子、玻璃器皿等先清洗干凈，用高壓滅菌鍋滅菌，放入烘箱中60 ℃烘干備用。取1張常溫、常濕下保存的藍狐(北極狐，Vulpeslagopus)生皮，在皮張背部用打毛剪從根部剪取毛發約2 g放入燒杯中，加入1%的洗衣粉溶液(雕牌含酶洗衣粉)100 mL，用無菌玻璃棒攪拌2 min，轉移到新的無菌燒杯中，加入無菌去離子水清洗2遍。移入75%的酒精中浸泡10 min，放到無菌的培養皿中，超凈工作臺上將水分自然蒸干(也可以用鼓風式烘箱加速水分蒸發)。用鋁箔紙密封，室溫保存備用。

1.2 細菌的清洗

用CP513型電子天平(OHAUS，美國)稱15份毛發樣品，每份7 mg，分別移入15個無菌的1.5 mL離心管中。本實驗使用4種不同的處理方法來處理毛發樣本，每種處理方法做3個重復，標記為I(I#1、I#2、I#3)—IV(IV#1、IV#2、IV#3)，最后一組V(V#1、V#2、V#3)作為對照組，清洗之后未加處理。毛干操作步驟如下。

1.2.1 取500 μL SDS溶液(10%)和500 μL NaOH溶液(4 mol/L)加入試管I中，短暫震蕩30 s，室溫放置15 min，小心移去液體，加入1 000 μL無菌去離子水，震蕩30 s，移去液體，重復漂洗1次，移去液體。把毛干移入新的試管，加入1 000 μL 95%的乙醇保存備用。

1.2.2 取1 000 μL溶菌酶溶液(30 mg/mL)加入試管II中，震蕩30 s，隨后置于37 ℃水浴鍋中水浴45 min，移去液體，用1 000 μL無菌去離子水漂洗2遍，再加入1 000 μL 1%的SDS溶液，置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液體，加入無菌的去離子水漂洗2遍，去除液體。向試管III中加入1 000 μL 1%的triton X-100[14]，將試管III置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液體，加入無菌的去離子水漂洗2遍，去除液體，移入新管，以95%乙醇浸泡保存備用。

1.2.3 向試管IV中加入1 000 μL的1.5%SDS溶液，短暫震蕩30 s，置于65 ℃水浴中40 min，移去液體，隨后將毛干放入裝有65 ℃ 4 mol/L的NaOH溶液的試管中，用鑷子夾住毛發，上下擺動，20 s后，迅速拿出，用去離子水沖洗3遍。移入新管，以95%乙醇浸泡保存備用。

為了進一步驗證NaOH溶液處理的有效性，增加兩組實驗，將處理時間從20 s延長到35 s和50 s，其他處理過程不變，樣本分別標記為IV(IV#135、IV#235、IV#335)，IV(IV#150、IV#250、IV#350)。

1.3 DNA的提取

在超凈工作臺內，將毛發樣品取出室溫下放置5 min以上，使乙醇自然揮發。轉至1.5 mL的無菌離心管內，按原樣編號。用剪刀把樣品剪碎，每個試管中加入400 μL TNE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH=8)、45 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、45 μL DTT(0.15 mol/L)和35 μL SDS(10%)，稍微震蕩混勻，56 ℃水浴中消化4 h后，再加入30 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，繼續消化3 h，隨后使用動植物基因組磁珠法提取試劑盒(中科雷鳴，中國北京)進行提取，具體操作步驟見說明書。

1.4 提取DNA的驗證

為了確定提取成功，以藍狐mtDNA上一個142 bp的片段和細菌pDNA上一個187 bp的片段為標記，分別進行PCR擴增。pDNA擴增引物Np為F：5′-CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC-3′，R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3′；mtDNA片段擴增引物Nmt為F：5′-CACGTCGTATACCAACGCCT-3′，R：5′-GG- GTTGTCCTAGGAGTGCAAA-3′；2對引物的Tm均為56 ℃，可采取同樣的擴增體系和擴增程序。

擴增反應在10 μL體系中進行，PCR反應體系含有2×RapidTaqMaster Mix(南京維諾贊生物科技有限公司)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，DNA模板2 μL，去離子水2.4 μL。混勻后瞬時離心，用9700型PCR擴增儀(GeneAmp，美國)進行擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；循環結束后72 ℃延伸5 min。采用同樣的擴增體系和擴增程序。

從2個擴增反應中各取1.5 μL的擴增產物進行混合，在1.5%瓊脂糖膠進行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，100 V下電泳22 min。

1.5 動物DNA和細菌DNA豐度的變化

為了檢測不同處理方法對細菌清除的效果，以動物的mtDNA和細菌的質粒DNA(pDNA)為目標，通過相對熒光定量PCR方法分別測定相對Ct值。mtDNA的擴增引物(Nmt)和pDNA的擴增引物(Np)仍采用前述引物。為了提高擴增的特異性，將Tm都提升到60 ℃。二者的擴增體系和擴增條件相同。

PCR擴增體系為10 μL，包括1 μL DNA溶液、5 μL TB Green Premix ExTaqII(Takara，大連)，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL和3.2 μL去離子水。擴增條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；循環結束后72 ℃延伸10 s。反應用CFX384 Real-Time System 熒光定量儀(BIO-RAD，美國)完成，在每一個循環延伸步驟結束后立即收集熒光信號并顯示結果。

用mtDNA的Ct值(Ctm)與細菌pDNA的Ct值(Ctb)的比值及它們Ct值的變化情況作為衡量細菌清除效果的標準，比值越低，pDNA的Ct值升高的越多，說明細菌的pDNA拷貝數越少，處理效果越好。

2 結果

2.1 DNA提取效果的定性檢驗

為了驗證上述實驗中已經成功獲得了毛干DNA，以提取的DNA溶液作為模板，擴增藍狐mtDNA上142 bp的片段和細菌pDNA上187 bp的片段。如圖1，所有的處理都可以同時擴增出2個目的片段，說明這些處理中都成功提取到DNA，但都沒有把細菌完全消除干凈。泳道5上除了2條目的片段之外，還在下面出現了明顯的引物二聚體，而且目的片段的信號強度比前幾個泳道有所降低，尤其是細菌pDNA的片段信號衰減相對明顯，說明所提取的DNA總量有所減小，細菌DNA的量減少更明顯。

2.2 不同處理方法對細菌清除效果的定量檢測

引物Nmt和Np的熔解曲線如圖2所示，它們的熔點峰值分別為82.5 ℃和87 ℃左右，熔解曲線峰值點高度重合，且僅有1個峰值點，說明引物無二聚體，無非特異性擴增及其他外源DNA污染，引物設計完全符合實驗要求，保證實驗結果的真實性。

圖1 藍狐毛干在4種方法處理下mtDNA和細菌pDNA的擴增產物的電泳圖Fig.1 Electrophoretic gram of amplicons of mtDNA and bacterial pDNA using DNA extracted from blue fox hair shaft cleaned with 4 different methods 注：M為DL2000 DNA marker；泳道1—3為樣本I#1—III#1；泳道4為對照樣本V#1；泳道5為樣本IV#1在65 ℃的4 mol/L NaOH中保留20 s Note：M is DL2000 DNA marker.Lane 1-3 are sample I#1-I#3.Lane 4 is control sample V#1.Lane 5 is sample IV#1 treated 4 mol/L NaOH at 65 ℃ for 20 s

圖2 引物Np和Nmt的熔解曲線Fig.2 Melt curves of primers Np and Nmt

采用熒光定量PCR檢測發現，未經處理的毛干(V#1—V#3樣本)中提取的總DNA中，mtDNA與細菌pDNA的Ct值分別是(15.53±0.15)、(16.82±0.03)，其比值為(0.923±0.009)。以這一比值為基準評估不同方法清洗后質粒DNA的數量變化。結果顯示，在常溫下經過SDS和NaOH雙重處理、溶菌酶處理以及Triton X-100處理，I—III樣品中mtDNA的Ct值分別為(17.86±0.42)、(16.15±0.48)和(16.23±0.45)；pDNA的Ct值為(16.98±0.10)、(17.02±0.18)和(17.14±0.14)。mtDNA與pDNA的Ct值之比均接近對照組的水平，分別為(1.052±0.026)、(0.949±0.037)和(0.947±0.033)。這表明這3種處理方法都未能有效洗脫毛發上的細菌。當把樣品在65 ℃的NaOH中保留20 s，mtDNA和pDNA的Ct值分別為(23.653±0.036)和分別為(26.6±0.345)，二者之間的比值為(0.889±0.01)，pDNA的Ct值有明顯變化，平均提高了(9.8±0.395)，說明這一處理方法使細菌DNA的拷貝數明顯下降，而mtDNA的相對比例也有所提高，二者的差異擴大了近10倍。

為了進一步驗證NaOH溶液中處理的時間對細菌DNA清除效果的影響，在20 s的基礎上，分別延長到35 s和50 s，其他實驗步驟不變。結果顯示，當處理時間延長到35 s時，其中一個樣本(IV#135)的mtDNA和pDNA均無數值顯示，另外兩組(IV#235，IV#335)的mtDNA的Ct值分別達到25.53和26.45，pDNA的Ct值分別為28.50和30.22，較處理20 s相比，分別提升了(2.33±0.42)和(2.85±0.43)，這說明將溫度提升到35 ℃時，此方法對細菌DNA和mtDNA的影響基本相一致，還可能導致提取失敗。當處理時間延長到50 s時，在DNA洗脫過程中，磁珠由原來的分散狀態轉變為凝聚狀態，反復震蕩也無法分散，使后續步驟無法進行。所以，就目前的方案而言，最佳處理時間為20 s左右即可。

圖3 4種處理方法(I—IV)與對照組(V)mtDNA和pDNA的Ct值的比較Fig.3 Comparison of the Ct values of mtDNA and pDNA among the four cleaning methods and the control group

3 討論

由于毛干具有穩定的化學結構、取材便利及易保存等特點[7]，人們將其視為獲取動物DNA的重要來源。很多文獻報道使用從毛干中提取的DNA做PCR擴增時，實驗結果大都不盡人意，尤其是nuDNA擴增的成功率極低。雖然人們從提取方法、擴增條件等方面進行優化，但也難以獲得有效提升[9，15]。

本研究首先評估了毛發經過普通清洗后(樣本V)，獲得的總DNA可以同時擴增出mtDNA和細菌pDNA的目的片段，顯示二者同時存在(圖1)。熒光定量PCR的檢測顯示，mtDNA和pDNA的Ct均值分別為(15.53±0.15)和(16.82±0.03)，二者的比值為(0.923±0.009)。說明細菌DNA的數量與動物的mtDNA相差不多。因為nuDNA比mtDNA低至少3個數量級[16]，所以如果細菌DNA在總DNA中占優勢，nuDNA的擴增效率就會受到顯著影響。因此在DNA提取之前清除細菌是非常必要的。

我們以樣本V為基準測試了4種處理方案的效果。方案I中采用去垢劑SDS和NaOH處理，期望通過陰離子表面活性劑和NaOH共同對細菌進行裂解，但是pDNA和mtDNA的拷貝數并未發生差分。方案II中采用溶菌酶來裂解細菌，達到消除的目的。但是雖經長時間的作用(45 min)，也沒有把pDNA和mtDNA的拷貝數進行有效差分，說明溶菌酶的作用效率不高。方案III中采用了非離子表面活性劑triton X-100提高體系的浸潤性和細菌的洗脫效果，但也沒有獲得滿意的效果。方案IV中采用了熱的高濃度NaOH(65 ℃，4 mol/L)短時間作用(20 s)，達到了2種DNA的有效差分，pDNA的拷貝數下降了3個數量級而使動物DNA成為優勢(圖3)。

以上結果說明，第一，細菌對毛干的黏附力很強，采用洗衣粉溶液、陰離子去垢劑和堿液等一般的方法無法徹底清除；第二，細菌的裂解比較困難，溶菌酶等溫和條件不能達到滿意效果，只有通過熱的強堿溶液才能裂解，并從毛干上脫落下來。

然而，延長強堿的處理時間(從20 s延長到35 s和50 s)未能獲得更好的效果，相反，還嚴重影響了DNA提取效率，甚至引發了磁珠的凝聚。推測可能有兩個原因，一是在較高溫度下延長作用時間之后，強堿破壞了毛干結構并進入毛干，裂解了殘存的DNA；二是強堿進入毛干后，在下游的漂洗步驟中不能有效漂洗出來，強堿被帶入磁珠捕獲步驟，改變了磁珠表面性質，引發凝集。

綜上所述，采用熱的強堿溶液可以有效清除毛干上的細菌DNA，65 ℃時最佳處理時間在20 s左右。雖然未對溫度進行梯度測試，但也不推薦使用65 ℃以上的高溫，避免強堿對毛干和DNA的降解作用過于激烈。另外，本研究僅測試了藍狐的毛干，包括針毛和絨毛。但是，哺乳動物毛發結構和化學組成大同小異，應該具有普遍意義。而鹿科(Cervidae)動物的毛干屬于薄壁中空的結構，承受強堿作用的能力較低，作用時間可能更要縮短，需要另行摸索。