天麻素提取工藝的優(yōu)化驗證*

李 晨，葉 琳，李 羿，溫榮城，陳宇航

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610500)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國傳統(tǒng)珍貴中藥材[1]。天麻有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，適用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、驚癇抽搐等證。天麻主要含天麻素及其苷元、天麻多糖、生物堿、有機酸、香草醇等，天麻主要活性成分為天麻素[2]。研究[3-4]報道，天麻素有抗驚厥和神經(jīng)保護(hù)等作用。本研究用醇提法從天麻中提取分離天麻素，通過單因素法和正交試驗法考察和優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù)，旨在為天麻資源的科學(xué)開發(fā)和合理利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Angilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UPH-II-10T 優(yōu)譜系列超純水器，四川優(yōu)譜超純科技有限公司；靜音無油空壓機 FX900-30，上海菲克蘇工具有限公司；FA1204電子天平，上海皓莊儀器有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-DIII 循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

天麻素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：MUST-18030827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.00%)，成都曼思特生物科技有限公司；磷酸(分析純)、乙腈(色譜純)，成都金山化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

實驗藥材購于成都新都區(qū)長春大藥房，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院李羿教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia.elataBl.的干燥塊莖。將藥材粉碎過2號藥典篩[5]，備用。

1.2 天麻素提取

稱取天麻藥材粉末5 g，置于100 mL燒杯中，加入55%乙醇30 mL，用保鮮膜封住燒杯口。有研究[6]報道，溫度對天麻素提取率影響較小,故選擇適當(dāng)?shù)臏囟?0 ℃水浴提取60 min[7]，連續(xù)提取2次。減壓抽濾，合并濾液備用。

1.3 天麻素含量測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品母液配制 精密稱取干燥至恒重的天麻素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，加適量流動相溶液溶解，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得到濃度500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液。

1.3.2 供試品溶液制備 精密移取醇提濾液1 mL，置10 mL離心管中，氮吹1.5 h，殘渣加1 mL流動相溶解完全，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，用0.45 μm濾膜濾過，即得。

1.3.3 色譜條件[8]色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相:乙腈-0.05%磷酸水溶液(5∶95)；檢測波長221 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃。

1.3.4 天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 按0.125、0.25、0.5、1、2、4 mL的體積梯度，精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，使?jié)舛确謩e為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。色譜條件按1.3.3項操作，進(jìn)行含量測定，記錄峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.3.5 穩(wěn)定性 稱取樣品1份，天麻素的醇提按1.2項操作，待測品溶液制備按1.3.2項操作，色譜條件按1.3.3項操作。在室溫條件下分別放置0、2、4、6、8、10、12 h后，進(jìn)樣測定天麻素峰面積并計算其RSD值。

1.3.6 精密度 精密移取1 mL同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液(200 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，色譜條件按1.3.3項操作，記錄天麻素峰面積，計算其濃度和RSD值。

1.3.7 重復(fù)性 稱取6份同一批樣品，天麻素的醇提按1.2項下操作，待測品溶液制備按1.3.2項操作，色譜條件按1.3.3項操作，測定天麻素峰面積并計算其RSD值。

1.3.8 加標(biāo)回收率考察 精密稱取5份已知含量的天麻樣品粉末，分別精密加入天麻素對照品適量，天麻素的醇提按1.2項操作，待測品溶液的制備按1.3.2項操作，色譜條件按1.3.3項操作，測定天麻素峰面積，計算回收率和RSD值。

1.3.9 天麻素提取率計算 移取適量供試品溶液，進(jìn)行含量測定，計算樣品中天麻素提取率=D×C×V/W×100%(C:天麻素濃度μg/mL；D:稀釋倍數(shù)；V:供試品溶液體積 mL；W:原料質(zhì)量μg)。

1.4 單因素試驗初篩影響因素[9-11]

將料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇提時間和醇提次數(shù)作為4個考察因素。

1.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對天麻素提取率的影響 精密稱取5 g天麻粉末7份。料液比1∶10，醇提溫度50 ℃，醇提時間60 min，醇提次數(shù)2次；再選取55%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 7個乙醇提取體積分?jǐn)?shù)。分別按1.2項、1.3項提取天麻素和測定含量，計算天麻素的提取率。

1.4.2 料液比對天麻素提取率的影響 精密稱取5 g天麻粉末6份。醇提溫度50 ℃，醇提時間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，醇提次數(shù)2次；再選取1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 7個料液比。分別按1.2項、1.3項提取天麻素和測定含量，計算天麻素的提取率。

1.4.3 醇提時間對天麻素提取率的影響 精密稱取5 g天麻粉末4份。料液比1∶10，醇提溫度50 ℃，醇提次數(shù)2次；再選取0.5、1、1.5、2 h 4個醇提時間。分別按1.2項、1.3項提取天麻素和測定含量，計算天麻素的提取率。

1.4.4 醇提次數(shù)對天麻素提取率的影響 精密稱取5 g天麻粉末4份。料液比1∶10，醇提溫度50 ℃，醇提時間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，再選取2、3、4、5次4個醇提次數(shù)。分別按1.2項、1.3項提取天麻素和測定含量，計算天麻素的提取率。

1.5 正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)

確定料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取次數(shù)此4個因素作為考察因素，每個因素選擇3個水平，每組以5 g原料計算，借助正交設(shè)計助手V 3.1軟件，進(jìn)入軟件界面選擇L9(34)正交表做正交試驗(表1)。

表1 正交試驗水平與因素設(shè)計

1.6 工藝穩(wěn)定性驗證

精密稱取天麻粉末3份[12]，每份均為5 g。按醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶16，醇提時間1.5 h，醇提次數(shù)4次的工藝參數(shù)進(jìn)行天麻素的提取分離，驗證工藝的穩(wěn)定性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)輸入計算機用正交設(shè)計助手V 3.1軟件處理和分析。采用正交設(shè)計表進(jìn)行正交試驗的數(shù)據(jù)分析，采用方差分析對各部分的變異與隨機誤差進(jìn)行比較。檢驗水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。采用WPS 2013繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液色譜圖

在1.3.3項色譜條件下，天麻素標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖為單峰(圖1)；天麻素待測品溶液的分離度均≥1，天麻素與其他組分基本分離(圖2)。

圖1 天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 天麻素供試品溶液色譜圖

2.2 天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線

天麻素在6.25～200.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖3)。回歸方程y=39.645x-23.125，r=0.999。

圖3 天麻素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 穩(wěn)定性考察 待測品溶液室溫分別放置0、2、4、6、8、10、12 h時，得到的天麻素峰面積分別為479.3、462.6、492.6、513.8、452.8、494.5和480.4。天麻素峰面積的RSD值為3.932%。

2.3.2 精密度考察 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的RSD值為0.065%，表明本實驗精密度良好(表2)。

表2 精密度實驗結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性考察 6份同一批樣品得到的天麻素峰面積分別為1452.9、1463.4、1473.6、1432.2、1398.5、1425.3。天麻素峰面積的RSD值為1.754%，表明本實驗重復(fù)性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率考察 平均回收率為112.44%，回收率的RSD值為1.246%，表明本實驗加樣回收率良好(表3)。

表3 加標(biāo)回收率考察結(jié)果

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%和85%時，天麻素提取率分別為0.450%、0.455%、0.454%、0.493%、0.449%、0.420%和0.356%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時天麻素提取率達(dá)到最高值0.493%，隨后天麻素提取率逐漸降低。因此，70%為較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.4.2 料液比 在料液比分別為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16和1∶18時，天麻素提取率分別為0.398%、0.439%、0.453%、0.471%、0.584%和0.506%。當(dāng)料液比為1∶16時，天麻素提取率達(dá)到最高值0.584%，隨后天麻素提取率降低。因此，1∶16為較佳的料液比。

2.4.3 醇提時間 在醇提時間分別為0.5、1、1.5和2 h時，天麻素提取率分別為0.336%、0.410%、0.397%和0.396%。當(dāng)醇提時間為1 h時，天麻素提取率達(dá)到最高值0.410%，隨后天麻素提取率緩慢降低。因此，1 h為較佳的醇提時間。

2.4.4 醇提次數(shù) 在提取次數(shù)分別為2、3、4、5次時，天麻素提取率分別為0.381%、0.493%、0.501%、0.568%。天麻素提取率隨提取次數(shù)的增加而逐漸增加。綜合考慮提取時間和提取成本，選擇3次為較佳的提取次數(shù)。

2.5 正交試驗

由正交實驗結(jié)果可知(表4)，4種因素對天麻素提取率影響的大小順序為：A>B>C>D。最優(yōu)工藝參數(shù)條件為：A1B2C2D2，即65%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，1∶16的料液比，1.5 h的醇提時間，醇提4次。方差的分析結(jié)果(表5)，再次借助正交設(shè)計助手V 3.1軟件選取離均差平方和最小的因素(D)作為誤差項進(jìn)行方差分析，僅有乙醇的體積分?jǐn)?shù)對天麻素提取率有顯著性影響，與文獻(xiàn)[6]報道結(jié)果相符。

表4 正交試驗結(jié)果

表5 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19

2.6 工藝穩(wěn)定性

天麻素提取率平均值為1.000%，RSD值為1.986%(表6),表明優(yōu)化的天麻素提取工藝穩(wěn)定可靠。

表6 醇提工藝的驗證結(jié)果(%)

3 討論

天麻素屬于酚苷類化合物，分子量(286.28)較小，極性較大。天麻素能溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿，因此，水、甲醇、乙醇等均可作為溶劑用于天麻素的溶劑回流提取。水提法耗時耗能，提取時淀粉易糊化，導(dǎo)致后續(xù)過濾、濃縮等操作較困難。有機溶劑提取法所需溶劑量較大，生產(chǎn)成本較高，易造成有機溶劑殘留和環(huán)境污染。綜合比較而言，乙醇具有價格低廉、無毒、穿透力強等優(yōu)點。因此，本研究選擇乙醇為天麻素的提取溶劑較為適合。

本研究用單因素法考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、醇提時間和醇提次數(shù)4個因素對天麻素提取率的影響，再利用正交試驗法優(yōu)化單因素法初篩的工藝參數(shù)，大大提高了研究效率。正交試驗法具有“均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實驗設(shè)計方法，但正交試驗法也存在精度不高、預(yù)測性不佳的缺點。而響應(yīng)面法采用非線性模型，能求得高精度的回歸方程，進(jìn)行合理預(yù)測來找出最佳工藝條件[13]。因此，可進(jìn)一步將響應(yīng)面法應(yīng)用于天麻素提取工藝的優(yōu)化。

綜上所述，乙醇溶劑回流提取法可與酶解提取法、超聲提取法、微波提取法等提取技術(shù)相結(jié)合，以期進(jìn)一步提高天麻素的提取分離水平。同時，開展天麻素的體外活性評價和藥效學(xué)研究。相信上述研究工作的開展必將對天麻素系列產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)和天麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的推動作用。