固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測定運動營養食品中葉酸的含量

陳 瓊,黃樹楷,黃 盼,許偉沂,龍 梓,彭麗詩

(仙樂健康科技股份有限公司,廣東汕頭 515041)

葉酸(folic acid,FA)即維生素B11,是蝶呤衍生物,也稱作蝶呤酰谷氨酸(pteroylglutamic acid,PGA),它可為核苷酸生物合成、氨基酸代謝和脫氧核糖核酸(DNA)甲基化提供單碳基團,能促進骨髓中造血幼細胞成熟,是所有生物機體細胞繁殖和胎兒的發育生長必需的維生素,故葉酸的缺乏可導致心血管疾病、神經系統疾病、消化系統疾病、誘發癌癥等,如巨幼紅細胞貧血、白血球減少癥、新生兒神經管畸形、智力退化、免疫力降低等[1-7]。因此,在許多的食品中,尤其是營養素補充劑和運動營養食品都把葉酸作為重要的添加物質。

通常運動營養食品中,葉酸的添加量低,基質較為復雜,常見配方中不僅含有牛奶、乳清及大豆等高蛋白的配料,而且還附帶谷物、水果等干擾成分,因此樣品前處理難度較大。而目前測定葉酸常用的方法有:比色法[8-10]、薄層層析法[11]、微生物法[12-16]和色譜分析法[17-23]等,其中比色法、薄層層析法雖操作相對簡單,但對于復雜基質樣品而言易受干擾,導致結果準確度不高。微生物法是經典方法,GB5009.211-2014 《食品中葉酸的測定》和EN 14131-2013 《Foodstuffs Determination of folate by microbiological assay》采用微生物法進行測定,靈敏度高,但也存在著許多的局限性,如實驗周期較長,方法重復性差,受樣品中抑菌成分的影響等[24]。AOAC-2011.06測定嬰兒配方奶粉和成人營養素中的總葉酸采用LC-MS/MS法,但由于液質法存在基質效應,會影響其穩定性和結果重現性[25-26],且液質相對檢測時間長,操作較為繁瑣。液相色譜法實現了葉酸與其他成分的分離,特異性高,但通常運動營養食品中葉酸的添加量較其他水溶性維生素低,若使用紫外檢測器時須加大取樣量,從而造成較為嚴重的干擾[27]。綜上,開發出操作便捷、靈敏度高、方法重復性及專屬性好的運動營養食品葉酸測定方法,有著重要的意義。

本文在現有的檢測方法基礎上,考察了沉淀蛋白法、酶解蛋白法、固相萃取法三種樣品前處理方法對比,并優化了提取溶劑與流動相的條件,以最優條件對運動營養食品中葉酸進行富集和純化,再讓弱熒光效應的葉酸經色譜柱分離,利用柱后衍生儀使葉酸與強氧化劑過二硫酸鉀進行反應生成有強熒光性的蝶呤-6-羧酸(如圖1),最后通過熒光檢測器檢測,外標曲線法定量。

圖1 葉酸的氧化反應方程式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

運動能量棒(標簽葉酸含量19 μg/g)、運動代餐粉(標簽葉酸含量15 μg/g)、運動代餐奶昔(標簽葉酸含量21 μg/g) 天貓旗艦店;反相弱陰離子交換Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3 mL) 美國Phenomenex公司;反相硅膠吸附C18固相萃取小柱(20 cc)、混合模式陰離子交換 Oasis MAX固相萃取小柱(20 cc) 美國Waters公司;葉酸標準品 含量95.3%,中國食品藥品檢定研究院;乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;磷酸二氫鉀、磷酸、氨水 色譜純,德國CNW公司;鹽酸 分析純,西隴科學;甲醇 分析純,廣州化學試劑廠。

1260型高效液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國Agilent公司；Pinnacle PCX柱后衍生儀 美國Pickering公司;Tissuelyser-24冷凍研磨 上海凈信實業發展有限公司;CASCADA I型超純水機 美國PALL公司;XS205DU型分析天平 瑞士METTLER-TOLEDO公司;UNIVERSAL 320R型離心機 德國Hettich公司;DZKW-D-2型水浴鍋 上海科恒實業發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制 提取劑:取2.5 mL濃氨水,加水約950 mL,用鹽酸調節pH至8.5,加水定容至1000 mL。

50 mmol磷酸二氫鉀(pH3.5):取磷酸二氫鉀6.8 g溶于950 mL水中,用磷酸調節pH至3.5,加水定容至1000 mL。

5%過二硫酸鉀溶液:取5 g過二硫酸鉀,加水定容至1000 mL。

1.2.2 標準溶液配制及標曲繪制 精密稱取50 mg葉酸標準品至50 mL容量瓶中,用提取劑溶解并稀釋得到濃度為1 mg/mL的標準儲備液。分別吸取標準儲備液用水稀釋得到濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/mL的標準曲線溶液。分別吸取標準溶液和樣品溶液適量,按色譜條件進樣分析,根據保留時間定性,標準曲線法定量。

1.2.3 樣品前處理方法的選擇

1.2.3.1 沉淀蛋白法 準確稱取粉碎均勻的試樣于燒杯中,用提取劑溶液60 ℃溶解后,轉入容量瓶中。加入10 mL 13%高氯酸溶液,混合均勻后靜止20 min。用提取劑定容至刻度,混勻離心,上清液過0.45 μm微孔濾膜后上機測定。

1.2.3.2 酶解蛋白法 準確稱取粉碎均勻的試樣于離心管中,加入適量蛋白酶與α-淀粉酶,提取溶劑適量,37 ℃水浴振搖2 h,轉入容量瓶中,用提取劑定容至刻度,混勻過濾,濾液過0.45 μm微孔濾膜后上機測定。

1.2.3.3 流動相優化 選用50 mmol/L磷酸二氫鉀水溶液∶乙腈=90∶10 (V/V)為流動相,保持流動相比例不變,用磷酸分別調50 mmol/L磷酸二氫鉀水溶液的pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,進樣測定。

1.2.4 樣品溶液的制備 由于運動營養食品中通常含有谷物粒、堅果碎、水果粒等顆粒較大的成分,且樣品本身黏度較大,若直接用粉碎機粉碎,會造成樣品粉碎不均勻且易黏附粉碎刀頭,造成卡機。本試驗采取液氮冷凍的方式對樣品進行預處理,再用冷凍球型研磨儀進行粉碎,保證了樣品粉碎的均勻性。樣品前處理具體操作如下:精密稱取經液氮冷凍粉碎均勻的樣品5～10 g至50 mL燒杯中,加入約25 mL提取劑,60 ℃水浴20 min,溶解后冷卻至室溫,用氨水或鹽酸調節pH至8.0±0.5,超聲提取10 min,時時振搖,轉移到50 mL容量瓶,用提取劑定容至刻度,5000 r/min離心10 min,精密吸取樣品上清液溶液1 mL,上樣于反相弱陰離子交換Strata-X-AW固相萃取小柱(依次用2 mL甲醇和2 mL水活化),待自然流干后,依次加入1 mL的25 mmol乙酸銨溶液(pH6～7)、1 mL甲醇淋洗柱床,棄去洗脫液。再每次用1 mL 5% NH4OH甲醇溶液進行洗脫2次,待自然流干后,吹出柱床內所有溶液并收集洗脫液,60 ℃以下氮吹至干,加提取劑定容至1 mL,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,待測。整個實驗過程應注意避光操作。

1.2.5 色譜條件 檢測器:熒光檢測器;檢測波長:激發波長365 nm,發射波長440 nm;柱前流動相:50 mmol磷酸二氫鉀(pH3.5)∶乙腈=90∶10;流速:1.0 mL/min;色譜柱:Venusil MP C18,4.6 mm×250 mm,5.0 μm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;柱后衍生劑:5%過二硫酸鉀溶液;衍生體積:0.5 mL;衍生溫度:60 ℃;衍生儀流速:0.3 mL/min。

1.3 數據處理

色譜結果積分處理采用1260型高效液相色譜儀配套的Agilent ChemStation色譜工作站,并利用Excel軟件進行數據統計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

2.1.1 沉淀蛋白法 高蛋白含量樣品的前處理中,沉淀蛋白并提取目標物是最常用手段,而效果較佳常見的蛋白沉淀劑有亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、三氯乙酸和高氯酸等。亞鐵氰化鉀和乙酸鋅混合會生成亞鐵氰化鋅,可與蛋白質共沉淀,但同時也會與少部分葉酸結合沉淀,造成目標物的損失。而三氯乙酸則會破壞葉酸的蝶啶環,使后續氧化衍生無法進行,高氯酸既可兼顧除蛋白質,又可保證葉酸的蝶啶環不被破壞,故選擇高氯酸沉淀劑進行實驗。3組平行實驗測定結果如表1,實驗發現沉淀蛋白法回收率在78.7%～88.4%之間,去除蛋白效果雖好,但仍有部分目標物損失,可能原因是在低于蛋白質等電點的pH下,蛋白質陽離子與高氯酸陰離子下形成難溶性鹽,蛋白變性從而沉淀,該沉淀形成過程迅速,導致沉淀物內部包裹住少量葉酸分子,形成包埋,導致部分葉酸損失。

表1 沉淀蛋白法測定葉酸含量

2.1.2 酶解蛋白法 葉酸標準品色譜圖見圖2,酶解樣品色譜圖見圖3,結果發現蛋白被酶解成多肽、氨基酸等亦進入樣品溶液,使目標峰被干擾,酶解法前處理效果不理想。可能的原因為蛋白酶是酶解蛋白最常見的酶之一,其作用機理是識別肽鍵兩側的氨基酸殘基的特定R基,與之結合使肽鍵斷裂[28],從而使蛋白大分子瓦解。而淀粉酶是重要的淀粉水解酶,其作用于淀粉時從淀粉分子的內部切開α-1,4糖苷鍵,生成糊精和還原糖[29-30],水解下來的小分子在該激發波長與發射波長下同樣有熒光吸收,從而造成了目標峰被干擾。

圖2 葉酸標準品色譜圖

圖3 酶解法樣品色譜圖

2.1.3 固相萃取法(C18、MAX、STRATA-X-AW) 固相萃取能有效地將分析物與干擾組分分離,減少目標色譜峰的干擾,是分離凈化常用手段。選用市售C18小柱、MAX小柱、STRATA-X-AW小柱對運動能量棒樣品溶液進行SPE純化,結果以目標物的加標回收率作為比較依據。結果發現,相比其他兩款小柱,反相弱陰離子STRATA-X-AW小柱對樣品提取液的凈化效果最好,加標回收率最高,主要是因為在弱酸性條件下,STRATA-X-AW小柱能夠吸附具有一定酸性的葉酸目標物,淋洗雜質后,再進行洗脫,洗脫液較為干凈,雜質少,起到很好的凈化效果。

表2 不同固相萃取柱回收率

圖4 STRATA-X-AW小柱凈化樣品色譜圖

2.2 流動相優化

葉酸水溶性較差,水中溶解度只有1.6 μg/mL,常用0.5%氨水溶液(pH約10)作為提取劑使葉酸轉化成葉酸鹽,增加其溶解度及穩定性。實驗中發現流動相磷酸鹽緩沖液的pH對衍生反應產物保留能力及穩定性有一定的關聯,分離結果表明,流動相pH在2.0～3.5時,pH越小葉酸的保留時間越往后延,且此時體系緩沖能力不夠,從而導致重復性不佳。當pH在3.5以上對葉酸的保留時間影響較小,重復性仍然不佳。但是pH越大,基線越不平穩。而低pH對色譜柱、色譜系統的壽命也有影響。當pH=3.5時,體系緩沖能力剛好能符合重復性要求。綜合考慮,實驗使用鹽酸調節其提取劑pH為8.5,同時選用pH為3.5的磷酸二氫鉀水溶液∶乙腈=90∶10 (V/V)作為流動相,既能使得目標溶液處于緩沖液能力范圍內,保留時間穩定,又能使得基線穩定,對色譜系統無影響,能滿足檢測色譜條件要求。

2.3 方法驗證

2.3.1 標準曲線、線性范圍與儀器定量限 在最佳色譜條件下,檢測一系列葉酸標準溶液(0.2～2.0 μg/mL),以標準溶液的濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制線性回歸標準曲線,結果發現方法在0.232～2.318 μg/mL范圍內呈良好的線性關系,回歸方程為y=12.496x-0.04687,決定系數R2=0.9971。以10倍信噪比(S/N)計算,進樣量為10 μL,該方法的儀器定量限為0.0774 μg/mL。

2.3.2 重復性、專屬性及回收率 按最佳色譜條件,對市售運動能量棒樣品進行6 次檢測。結果表明該方法重現性較好,峰面積相對標準偏差為2.5%,測定結果較為穩定。分別取陰性樣品各9份,每份5 g,分成3組,每組平行3個樣,加入不同體積的標準儲備液,分別配制成與待測樣品中葉酸80%、100%、120%含量的回收率樣品,按照方法測定葉酸含量,測定結果如表3,回收率在96.98%～100.50%之間,相對標準偏差在0.98%～3.76%之間,方法回收率良好,準確度較高,陰性樣品未檢出,見圖5,適用于不同基質葉酸的測定。

表3 加標回收率測定結果

圖5 陰性樣品色譜圖

2.3.3 溶液穩定性 每隔適當時間測定標準品溶液(濃度為1.2 μg/mL)葉酸濃度的百分比及市售樣品葉酸含量的百分比,考察溶液穩定性。結果如表4,在該實驗條件下,標準品溶解和三款運動營養產品能在8 h內保持穩定(98.54%～102.90%),可滿足檢測要求。

表4 標準溶液及樣品溶液穩定性

3 結論

本文開發了固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測定運動營養食品中葉酸含量的方法。分別考察了沉淀蛋白法、酶解蛋白法及固相萃取法的樣品前處理方式及流動相的優化條件,樣品經反相弱陰離子固相萃取小柱純化,C18色譜柱分離,柱后衍生儀氧化衍生后,再經熒光檢測器,外標法定量。結果表明,在0.232～2.318 μg/mL范圍內方法線性良好,R2=0.9971,進樣量為10 μL,方法的儀器定量限為0.0774 μg/mL,靈敏度足以滿足運動營養食品中葉酸的檢測需要,方法回收率在96.98%～100.50%之間,標準品、樣品溶液在8 h內穩定。本方法很好地解決復雜基質的運動營養食品中葉酸的提取、凈化除雜等問題。操作方便快捷,結果準確,線性范圍廣,靈敏度高,重現性、專屬性、回收率及穩定性較為滿意,能夠滿足運動營養食品中葉酸含量檢測的需求。