電子鼻結合GC-MS分析不同處理藍莓貨架期間果實的揮發性成分

薛友林,董立超,張 鵬,李春媛,李江闊

(1.遼寧大學輕型產業學院,遼寧沈陽 110036;2.國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津),農業農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室,天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室,天津 300384)

藍莓又名越橘,因其是深藍色的小漿果類也被叫作藍漿果，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vac-cinium)植物,藍莓中含有豐富的花青素、黃酮、酚、醛等成分[1],藍莓中因有預防癌癥糖尿病、神經衰退清除抗氧化自由基等功能為人們所熟知[2]。藍莓果實為圓形,成熟果實口感細膩,風味獨特,營養豐富,堪稱“世界水果之王”,被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一[3]。但是藍莓果實不耐貯存,果實腐敗后常產生不愉快氣味,電子鼻是一種新型仿生技術,通過模擬動物嗅覺系統,收集食品樣品氣味的指紋數據來實現品質評價,其具有準確度高、重復性好、不存在人的主觀臆斷的特點而優于感官評價,廣泛應用于食品領域,尤其是在果蔬保鮮領域中是一種非常好的無損檢測方法[4],通過與頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用可分析鑒定面包、線椒、海參、竹葉等揮發性成分變化[5-8]。

中國對于藍莓的貯藏保鮮已研究出多種方法,最常用是低溫、CAP、MAP、1-MCP等方法的聯合處理[9-11]。但對于貯藏后的銷售過程,國內學者研究較少,常溫放置的藍莓存放2～3 d品質就會劣變,目前針對超市中的藍莓保鮮,在銷售過程中大多放置低溫貨柜內保藏,采取塑料盒包裝結合低溫的保鮮模式。目前學者們對藍莓貨架期內揮發性成分的報道較少,且大多是從生理、品質指標分析藍莓貨架期間成分變化,本實驗以不同保鮮方法冰溫貯藏30 d后的藍莓為實驗對象,模擬大多數超市貨架溫度4 ℃,運用電子鼻結合GC-MS技術分析進行藍莓貨架期間揮發性成分的變化,以期為藍莓保鮮貯藏提供一些技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藍莓品種,萊克西 采自浙江寧波森田藍莓采摘園；便攜式塑料氣調箱(規格:28 cm×22 cm×12 cm,內置2個籃筐,箱2個側面分別有3個氣調窗,其中左右氣調窗為在長2 cm寬1.5 cm的長方形中開橫4豎3的直徑為1 mm的12個圓孔,中間為長2 cm寬1.5 cm的長方形氣調窗,氣調箱配套氣調元件) 寧波國嘉農產品保鮮包裝技術有限公司；1-MCP便攜式包裝 國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)提供。

3-30K離心機 德國SIGMA公司;恒溫水浴鍋 金壇市金南儀器制造有限公司;PEN3 型便攜式電子鼻 德國Airsense公司;固相微萃取手柄和50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭,美國Supleco公司;PC-420D數字型磁力加熱攪拌裝置 美國Corning公司;Trace DSQ MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材處理 采摘時選取大小一致、無機械損傷與病蟲害的成熟果實,階段預冷(3.5～4.5 ℃條件下預冷6～10 h,-1.6～-1.2 ℃溫度下馴化6～8 h)后直接裝入便攜式塑料氣調箱中做相應處理:a. 1-MCP:供試藍莓果實裝于便攜式塑料氣調箱內(2.4 kg/箱),放入1-MCP藥品(空間1-MCP濃度1.0 μL/L),扣蓋并粘貼封閉氣調元件,處理24 h后,打開封閉氣調元件;b. MAP:供試藍莓果實裝于便攜式塑料氣調箱內(2.4 kg/箱),扣蓋并粘貼氣調元件;c. 1-MCP+MAP:供試藍莓果實裝于便攜式塑料氣調箱內(2.4 kg/箱),放入1-MCP藥品(空間1-MCP濃度1.0 μL/L),扣蓋并粘貼氣調元件;d. 對照(CK):供試藍莓果實裝于便攜式塑料氣調箱內(2.4 kg/箱),不粘貼氣調元件。然后,通過順豐冷鏈物流車運至實驗室并放入冰溫庫((-0.5±0.3) ℃),預冷24 h后貯藏30 d。然后將四組處理藍莓從冰溫庫取出,挑選完好成熟的藍莓裝入貨架零售盒內置于4 ℃冰箱內。分別在貯藏的第0、3、6、9、12 d時取樣,利用電子鼻和GC-MS測定藍莓揮發性成分的變化。

1.2.2 電子鼻檢測方法 PEN3便攜式電子鼻由金屬氧化物氣體傳感器陣列、氣體采樣裝置和信號處理單元組成,傳感器具有10個金屬氧化物半導體型化學傳感元件,如表1所示每種傳感元件對應的敏感成分類型不同。取藍莓35個于潔凈干燥的600 mL燒杯中,用保鮮膜封口,在常溫下封口平衡10 min后采用頂空吸氣法進行數據采集。測定條件:傳感器清洗時間70 s,自動調零時間10 s,樣品準備時間5 s,樣品測試時間50 s,樣品測定間隔時間1 s,內部流量100 mL/min,進樣流量100 mL/min。為了保證實驗數據的穩定性和精確度,選取測定過程中第48～50 s的數據用于后續分析。為了消除漂移現象,更好地保證測量數據的穩定性和精確度,要求每次測量前后,傳感器都要進行清洗和標準化。統計分析10個不同選擇性傳感器的G/G0值。每個處理重復測定6次。

表1 電子鼻傳感器名稱與其響應成分

1.2.3 HS-SPME-GC-MS測定方法 采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜/質譜分析(GC-MS)聯用法測定,選用100 μm PDMS萃取頭;氣相色譜條件:HP-INNOWAX色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升溫:40 ℃保留2 min,然后以2 ℃/min升至150 ℃保留1 min,再以5 ℃/min升至210 ℃保留5 min。傳輸線溫度為250 ℃。載氣為He,流速1 mL/min,不分流。質譜條件:連接桿溫度280 ℃,電離方式為EI,離子源溫度200 ℃,掃描范圍35～350 amu。通過檢索NIST/WILEY標準譜庫,進行定性分析,用峰面積歸一法測算各揮發性成分的相對含量。

1.3 數據處理

通過NIST/Wiley標準譜庫檢索,結合文獻的標準譜圖,進行定性分析,并用峰面積歸一法測算各化學成分的相對含量。利用電子鼻Winmuster分析軟件對采集到的數據進行分析,選取48～50 s區間內的平穩數值,采用負荷加載分析(loadings analysis,LA)及線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)。圖表采用Excel制作分析。

2 結果與分析

2.1 主成分分析貨架期藍莓揮發性成分

PCA是將數據降維并進行線性分類,得到主要的二維散點圖,可從復雜的揮發性成分中篩選出關鍵綜合分析因子[12]。在PCA分析中,對四種處理的電子鼻數據進行兩兩比較,其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻率分別為84.644%和12.717%,86.367%和10.907%,90.356%和7.181%,累計貢獻率分別為97.361%、97.274%、97.537%,其累計貢獻率都大于95%,表明了2個主成分已經能基本代表了樣本的主要信息特征,對于同一處理的藍莓,貨架期內藍莓雖然有主成分在不同區域,且分界明顯,但是仍有部分貨架時間重疊交叉未能明顯看出差異。可見,主成分分析方法并不能很好地區分不同貨架時間的藍莓。此外發現四種處理在貨架3 d時第一主成分位移均處于一個較高數值而后下降,可見3 d是貨架期藍莓主要揮發性成分的變化拐點,而聯合處理的藍莓在9 d時達到第一主成分位移最大可推測聯合處理對藍莓主要揮發性成分的釋放具有一定的抑制效果。

圖1 不同處理的主成分分析

2.2 線性判別分析貨架期藍莓揮發性成分

線性判別分析(linear discrimination analysis LDA)是一種將原始數據投影到低維的方向,以所采集揮發性成分響應值的空間分布狀態及彼此間的投影距離表現氣味變化的速率,是判別函數分析的前提。與PCA(主成分分析)相比,LDA能夠收集傳感器所有信息并進行標準正常化轉換,更好地解決分類問題,這在蘋果、海棠果、杏鮑菇等果蔬中已廣泛應用[13-15]。從圖2中橢圓的分布位置來看,同一處理的不同貨架時間可明顯分開,可以看出貨架過程中藍莓揮發性成分差別明顯,說明LDA能夠很好地區分不同貨架時間下藍莓的揮發性成分,優于PCA分析。由圖2A可知,MAP處理較CK組,除3 d時二者第一判別式未有良好的區分,在其余貨架時間下均可有效地區分,以0和6 d最為明顯(距離越大表明變化越快、越明顯),說明MAP處理對藍莓品質有較為明顯的改變。

圖2B中顯示MAP與1-MCP在藍莓貨架期判別分析的結果,可以看出這兩種不同處理在0、3、6 d有著明顯的差異,說明這兩種處理對藍莓貨架前期有著明顯的改變。

圖2C中可看出,MAP+1-MCP處理相較1-MCP單獨處理,對藍莓貨架貯藏期間并未有明顯改善,區域并未完全分離,可見對于揮發性的香氣成分1-MCP與MAP+1-MCP相差不大,需要進一步借助GC-MS等儀器進行進一步分析。

圖2 不同處理的LDA分析

2.3 載荷分析貨架期藍莓揮發性成分

載荷分析(loadings analysis):與PCA分析基于相同的算法,每個傳感器貢獻率系數在載荷圖PCA坐標系上的位置可以體現其變量解釋能力,即對特定氣味的分辨力,位于靠近原點位置的傳感器貢獻率最低,在當前分析中的重要性最差,遠離原點的傳感器貢獻率高[16]。

載荷分析的總貢獻率分別為97.361%、97.274%、97.537%,達到97%以上,基本代表了樣品的全部特征信息。利用電子鼻PEN3系統進行傳感器載荷分析表明,貢獻率最大的為傳感器W5S,其次為W1S、W2S、W1W等,可見藍莓揮發性成分中氮氧化物含量最高,這為之后的確定優化傳感器陣列方法,使電子鼻可以用更少的傳感器達到更好的分類效果,為電子鼻傳感器陣列優化提供了新的思路和方法[17]。

圖3 藍莓揮發性成分的載荷分析

2.4 藍莓貨架期間GC-MS檢測結果分析

從表2可知,用GC-MS共檢測出76種揮發性成分,可分為8大類:醇(16種)、烷烴(11種)、醛(9種)、酮(1種)、酯(6種)、萜(14種)、雜環烴(3種)、其他(16種),CK、MAP、1-MCP、MAP+1-MCP中分別檢測到45、41、38和43種化合物。實驗中檢測出的醛類主要為2-己烯醛(20.44%～82.42%)、己醛(0～12.91%);酮類主要為大馬士酮(0～0.31%);醇類主要為反式-2-己烯-1-醇(0～22.71%);萜類成分主要為芳樟醇(0～11.43%)、香葉醇(0.2%～15.10%);雜環類成分主要是3,6-二氫-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃(0～0.55%);烴類成分主要是3,7-二甲基-1-辛烯(0～0.71%);酯類成分主要是異戊酸甲酯(0～0.44%);其他類成分主要是2,6-二叔丁基對甲酚(0～1.77%),這些物質均為該類分組內相對含量較高的物質,其中主要構成成分的結果與其他研究學者相似[18-19]。

表2 藍莓貨架期揮發性成分相對含量變化

續表

HS-SPME-GC-MS對樣品的解析均在93%以上,檢測數據可代表整個樣品數據。其中醛類成分的相對含量變化較大,醛類(24.86%～91.98%)、醇類(0.24%～23.85%)、萜類(2.00%～43.00%),三者加和在貨架所有天數內均大于71%,可見這三種物質為藍莓內最主要的構成成分。在貨架過程中,不同處理后貨架期藍莓的揮發性種類會不同程度減少,1-MCP組尤為明顯,比CK組減少了7種化合物,但也有不同于其他處理組的化合物生成,如庚基氫過氧化物、5-異丙烯基-2-甲基環己醇等。實驗中發現了幾個特殊的物質,反式-2-己烯-1-醇這種物質在CK組和MAP組藍莓貨架9 d時相對含量分別為22.71%、20.48%,可以明顯看出使用1-MCP處理可明顯減少貨架期間內醇類物質的相對含量,相較CK組和MAP組,使用1-MCP的處理組,反式-2-己烯-1-醇均位于實驗儀器的檢測線以下,推測與1-MCP這一化合物的添加有關。由圖中還可以發現采用不同處理后可抑制貨架期中4-二甲基-3-環己烯-1-乙醛這種成分的合成時期,CK組在貨架3 d就能檢測出0.11%的4-二甲基-3-環己烯-1-乙醛,而經過MAP或1-MCP處理后的藍莓在貨架9 d時才被檢測出,而聯合處理的藍莓雖然在貨架6 d時被檢測到0.21%,但貯藏期內其相對含量遠低于MAP或1-MCP組,推測這種成分與藍莓衰老有著密切關系,且MAP與1-MCP聯合處理對這種成分生成的抑制效果較好。實驗中發現在MAP和1-MCP聯合處理的12 d,其他類中庚基氫過氧化物這種物質被檢出22.2%,推測其是藍莓衰老腐敗過程中醛類或者萜類的某種中間代謝產物。

此外,在揮發性成分中香葉醇具有類似玫瑰花的溫和香甜氣味,是一種重要的天然香精香料。芳樟醇主要是呈現濃青帶甜的木青氣息。在醛類中,2-己烯醛高濃度時具強烈的青草氣味,低濃度時則呈新鮮水果的清香味,由于這些成分的存在藍莓呈現出一種特殊風味[20]。在揮發型香氣成分中芳樟醇(0～11.43%)、橙花醇(0～1.30%)、香葉醇(0.2%～15.10%)為同分異構體,為藍莓貨架期萜類中主要的揮發性成分[21]。且從相對含量上看,最主要的揮發性成分為2-己烯醛、芳樟醇、香葉醇。

2.5 不同處理對貨架期藍莓揮發性成分相對含量的影響

由圖4可知,在藍莓貨架期過程中醛類物質是最主要的成分,在MAP處理的第3 d可高達91.98%。在貨架0～9 d時藍莓的醛類成分呈現出先升高后降低的趨勢,3 d時達到頂峰,且CK與MAP處理的藍莓下降趨勢極其相似,并于9 d時達到最低值,相反,醇類物質和萜類物質呈現出先降低后升高的相反變化,推測在貨架期間藍莓內醛類、醇類、萜類這三種成分通過某種代謝過程相互轉化,在成熟過程中先生成醛類成分而衰老過程生成醇、萜類成分[22]。在貨架12 d,CK、MAP的醛類出現了大幅度回升,此時藍莓處于即將腐爛的狀態,推測此時細胞衰老死亡體內大量的成分流出導致揮發性成分大幅變化,且揮發性成分喪失[23],但是對于MAP+1-MCP聯合處理的藍莓,其在12 d時出現了醛類成分大幅下降的情況,與其他處理組9 d時變化相似,可見1-MCP結合MAP處理可抑制在貨架后期醛類物質含量的減少,對于醛類這種物質的抑制,1-MCP也優于MAP、CK這兩組處理,以貨架9 d尤為明顯,1-MCP組未呈現一個斷崖式的下降[24],對于MAP與CK兩組可以發現對于醛類的含量,在貯藏期內除12 d外均高于CK組,可見其對于醛類物質的保留效果較好。對于醛類這一含量最高的物質抑制流失的效果順序為MAP+1-MCP>1-MCP>MAP>CK。

圖4 不同前處理方法對藍莓貨架期果實揮發性成分的變化

3 討論

1-MCP作為乙烯抑制劑的一種,在控制乙烯的成熟和成熟過程中起著重要的作用,乙烯的合成直接關乎藍莓的貯藏品質[25],藍莓冰溫貯藏30 d后在4 ℃的環境下進行貨架模擬,隨著貨架時間的延長果實內成分發生著明顯的改變。應用電子鼻對藍莓貯藏期間氣味進行主成分分析、線性判別分析和載荷分析,發現LDA 分析相較PCA分析能有效地將不同貨架時間的藍莓區分開來,且藍莓的氣味變化明顯,利用電子鼻無損檢測不同藍莓貨架期是可行的。通過結合HS-SPME-GC-MS及電子鼻對藍莓的測定,確定藍莓在貨架3 d后品質開始逐漸下降,表現3 d時醛類成分達到頂峰,隨后醛類物質相對含量均低于3 d時,結合主成分分析結果,可以看出貨架3 d是藍莓品質變化的一個拐點。

利用HS-SPME-GC/MS對藍莓貯藏期間的揮發性成分進行分析,共檢測出76種揮發性成分。其中以醛類成分種類最多含量最高,是藍莓的主要揮發性氣味成分,且醛類成分含量的變化規律與PCA分析中變化趨勢相近。但是由于1-MCP的添加和貨架期藍莓內進行著各種復雜代謝反應導致大部分揮發性成分(如芳樟醇、葉香醇、反式-2-己烯-1-醇等)的變化未有一個明顯的變化規律。

敏感的傳感器與HS-SPME-GC-MS分析所得的特征成分含量結果大致相符。實驗中發現一些傳感器在模式識別中負載參數近乎零,那么該傳感器的識別能力可以忽略不計,在后續試驗中可以嘗試將那些傳感器去除。

4 結論

針對PCA和LDA分析的圖像可以觀察到,3 d是貨架期藍莓主要揮發性成分的變化拐點,對于貨架期的判別,判別分析法優于主成分分析法。傳感器載荷分析表明,貢獻率最大的為傳感器W5S。HS-SPME-GC-MS所得結果中三大主要物質醛類(24.86%～91.98%)、醇類(0.24%～23.85%)、萜類(2.00%～43.00%)加和均大于71%,是藍莓內主要的揮發性物質。特征揮發性成分為2-己烯醛、芳樟醇、香葉醇。對于電子鼻結合GC-MS分析結果的探討,可見MAP+1-MCP聯合處理對藍莓延緩揮發性成分流失效果較好,對于醛類抑制流失的效果順序為MAP+1-MCP>1-MCP>MAP>CK。