瀏陽豆豉發酵過程中抗氧化成分及活性變化研究

陳 怡,劉 洋,蔣立文,李 跑,廖盧艷

(1.湖南農業大學食品科學技術學院,湖南長沙 410128;2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南長沙 410128)

豆豉是一類歷史悠久的發酵豆制品,擁有獨特的風味和較高的食用、藥用價值[1],深受消費者喜愛。本實驗研究的瀏陽豆豉是以泥豆或小黑豆為原料,經過自然制曲、洗曲、堆積發酵、曬干而成的典型的曲霉型淡豆豉,曾在馬王堆女尸墓中被挖掘,也因其獨特的風味廣受人們喜愛,是湘菜中不可或缺的一種調味料。屬于淡豆豉的瀏陽豆豉一直作為藥用原料在藥品中使用[2],李時珍的《本草綱目》記載到自梁代以來,淡豆豉就一直在醫學上廣泛應用,有開胃增食、消食化滯、發汗解表等功效[3]。

近年來,隨著國家大健康產業需要,人們逐漸開始重視食品的營養價值和保健功能,而氧化應激則被認為是造成許多慢性疾病如心血管疾病、糖尿病等的重要原因[4]。大豆及其制品含有多種天然抗氧化成分,如VE、VC、異黃酮等[5],表現出良好的抗氧化活性,其中大豆異黃酮是大豆及其制品中研究最多的抗氧化物質,是一種生物類黃酮。研究表明,大豆異黃酮共有12種,分別為占大豆異黃酮總含量97%～98%的結合型糖苷和占2%～3%的游離型苷元兩大類,游離型苷元主要以大豆素(daidzein)、大豆黃素(glycitein)、染料木素(genistein)為主,糖苷型則以大豆苷(daidzin)、大豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)為主[6]。試驗證明,人體利用大豆異黃酮苷元的速度遠高于糖苷型,且苷元型大豆異黃酮無論在抗氧化、抗脂質過氧化等方面均比糖苷型高[7]。大豆及普通大豆食品中的異黃酮主要是以糖苷形式存在,而在發酵過程中,大豆中的糖苷在微生物的作用下轉化為活性更高的異黃酮苷元,因此,發酵豆制品往往較大豆及其制品具有更強的生物活性[8]。現階段,對瀏陽豆豉較多的研究集中在發酵階段中氣味物質[9]的變化以及微生物多樣性分析[10]兩個方面,但關于發酵過程中抗氧化活性變化的規律缺乏探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瀏陽豆豉樣品 均采自與湖南梁嘉食品有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;蘆丁(rutin)、沒食子酸(gallic acid)、大豆苷(daidzin)、大豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆素(daidzein)、大豆黃素(glycitein)、染料木素(genistein) 標準品(純度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司;福林酚 合肥博美生物科技有限公司;乙腈、二甲基亞砜(色譜純) 天津市光復科技發展有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

AUY220微量分析天平 島津公司;Agilent 1100 servies高效液相色譜儀 安捷倫;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;Thermo Scientific Multiskan FC全波長酶標儀 上海旦鼎國際貿易有限公司;H-2050R高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;KQ3200E超聲波振蕩器 上海五相儀器儀表有限公司;KHW-S-4電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;0.45 μm針孔式濾膜 天津科億隆實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 樣品取自梁嘉瀏陽豆豉有限公司同批次豆豉產品不同發酵階段的瀏陽曲霉型豆豉(如圖1所示)樣品10個(L0、L1、L3、L5、L7、L9、L12F、L12S、L14、L20),共有10個,其中前發酵包括L0、L1、L3、L5、L7、L9共6個樣品,L12F、L12S分別為洗霉前后兩個樣,L12S～L20為渥堆發酵時期。樣品采用專用無菌袋包裝后-80 ℃保存,樣品均取好后,各樣經真空冷凍干燥后粉碎,過80目篩,置于-20 ℃冰箱中保存備用。

圖1 瀏陽豆豉制作過程以及取樣情況

1.2.2 大豆異黃酮含量的測定

1.2.2.1 樣品處理 參考國標GB/T 23788-2009 保健食品中大豆異黃酮的測定方法[11],精確稱取且記錄瀏陽豆豉樣品粉末0.400～0.500 g,加入80%甲醇溶液溶解后,倒入50 mL容量瓶中并加至接近刻度線,超聲(常溫,20 kHz,20 min)后定容。搖勻后8000 r/min離心15 min。取上層清液過0.45 μm針孔式濾膜備用。

1.2.2.2 色譜條件 Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動相A乙腈與流動相B磷酸水溶液(pH=3.0)梯度洗脫詳情見表1;流速1.0 mL/min;波長260 nm;進樣量10 μL;柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫參數

1.2.2.3 標準曲線的繪制 配制6種400 mg/L單標準品溶液,分別配制成8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mg/mL 5種不同濃度的混合標準溶液。

1.2.3 總黃酮含量的測定 樣品前處理:按照1∶30物料比(W/V))加入80%乙醇超聲(常溫,20 kHz,30 min),記錄樣品重量精確至0.001 g;采用硝酸鈉-硝酸鋁比色法[12],實驗步驟:加入0.40 mL NaNO2搖勻6 min,加入0.40 mL Al(NO3)3搖勻，放置6 min,再加入4 mL NaOH，用80%乙醇定容至10 mL,搖勻,15 min后510 nm下測定吸光值;標曲繪制:80%乙醇溶解40 mg蘆丁,定容至100 mL。吸取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mL蘆丁溶液,按照實驗步驟反應后測定吸光值,繪制標準曲線。

1.2.4 總多酚含量的測定 采用Folin-酚比色法進行測定[13]。標準曲線繪制:稱取沒食子酸25 mg溶解于100 mL蒸餾水中。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于5支比色管中,分別加入體積分數為10%的Folin-酚試劑2.5 mL和7.5 g/mL Na2CO3溶液2 mL,加水定容至10 mL。在45 ℃水浴中反應15 min,波長765 nm處測定其吸光度。樣品的測定:取提取液1 mL,按上述步驟操作,試驗重復3次,取平均值。

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定 以1∶10的比例用80%的乙醇溶解,并超聲提取30 min,8000 r/min,離心15 min,取上清液備用。分別取三支試管,依次標記為1、2、3,分別作為測試、對照、空白管。1、2號試管中各加入2 mL提取液,1、3號試管中分別放入1.5 mL 2 mmol/L DPPH,最后2、3號管分別加入中加入1.5 mL和1 mL的無水乙醇,反應30 min[14]。以上操作做三組平行,計算平均值。計算公式如下:

式中:A1為1.5 mL DPPH·溶液+1 mL樣品液的吸光度;A2為1 mL樣品液+1.5 mL無水乙醇的吸光度;A0為1.5 mL DPPH·溶液+1 mL無水乙醇的吸光度。

1.2.6 羥自由基(·OH)清除率的測定 取3支試管,第1支加入0.2 mL的10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.2 mL,10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.2 mL樣液、0.2 mL蒸餾水和0.2 mL,3%過氧化氫,搖勻37 ℃,1 h,于550 nm處測定吸光值。第2支試管中以0.2 mL的80%乙醇代替樣液,第3支中以0.2 mL蒸餾水代替過氧化氫,其余與第1支試管相同。計算公式如下:

1.2.8 總抗氧化能力測定 按照南京建成生物工程研究所總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒進行測定。

1.3 數據處理

試驗平行測定3次,采用Excel 2003、Origin 9.0、SPSS軟件對其數據進行數理統計分析與相關性分析。

2 結果與分析

2.1 瀏陽豆豉發酵過程中大豆異黃酮含量的變化

圖2是各標品的出峰時間以及標準曲線,大豆苷(14.586 min)標準曲線為:y=39269x-10463,R2=0.9997;大豆黃苷(15.653 min)標準曲線為:y=37741x-10470,R2=0.9995;染料木苷(20.811 min)標準曲線為:y=54862x-31384,R2=0.999;大豆素(31.261 min)標準曲線為:y=62736x-33920,R2=0.9983;大豆黃素(32.747 min):y=50738x-26673,R2=0.999;染料木素(40.908 min):y=83819x-87887,R2=0.9966。

圖2 標準樣品色譜圖

未發酵大豆中的大豆異黃酮主要為糖苷型的大豆苷、大豆黃苷、染料木苷,在發酵過程中,由于微生物能夠分泌β-葡萄糖苷酶,作用于異黃酮糖苷,使其完全水解為異黃酮苷元[15],三者被依次轉化為大豆素、大豆黃素、染料木素。研究表明,游離的苷元比糖苷更有廣泛的生物活性[16-18]。同時,研究發現異黃酮A環上酚羥基越多則抗氧化作用越強[19],且7-位氧苷的形成對其抗氧化活性十分不利[20],因而苷元具有更強的抗氧化活性。此外,由于苷元型大豆異黃酮分子量明顯低于糖苷型大豆異黃酮,如大豆素分子量為254.23,大豆苷的分子量為416.38,同等摩爾質量下的大豆素質量較大豆苷高38.94%,因此發酵過程中糖苷型異黃酮到苷元型異黃酮的轉化可能是導致瀏陽豆豉總黃酮含量(w/w)降低(圖3)的重要原因。

根據表2可知豆豉發酵過程中其大豆異黃酮的變化情況。在原料熟豆(L0)中異黃酮的總量最高，為(2696.05±7.25) mg/kg,但此時糖苷型大豆異黃酮占總量的85.75%。在豆豉發酵前期(L0～L12F),糖苷型大豆異黃酮總量從(2312.56±2.53) mg/kg降低至(598.53±0.59) mg/kg,而苷元型大豆異黃酮含量則上升至(866.52±5.10) mg/kg,二者分別占總量的40.08%和59.14%,說明糖苷型大豆異黃酮有明顯向苷元型異黃酮轉化的趨勢,這與索化夷等[21]對永川豆豉發酵過程中大豆異黃酮變化趨勢一致。在洗霉后(L12S),除大豆黃苷以外,其它各個組分都有下降現象,其中大豆苷和染料木素分別是糖苷型和苷元型大豆異黃酮中在洗霉前后下降幅度最大的組分,較洗霉前各下降了89.31%、45.55%。在后發酵渥堆期間(L12S～L20)糖苷型異黃酮含量持續下降,而苷元型大豆異黃酮快速增加,至發酵最后一天(L20)各占異黃酮總量的18.58%和81.41%。Zhi等[22]對大量文獻進行總結得出,產β-葡萄糖苷酶的微生物主要包括細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌等;石聰等[10]對瀏陽豆豉微生物研究表明在后發酵階段酵母菌以及細菌大量生成,說明在后發酵期間菌群的種類大幅度變化造成β-葡萄糖苷酶的增加可能是導致在此期間苷元型大豆異黃酮迅速增加的原因之一。

表2 瀏陽豆豉發酵過程中大豆異黃酮的變化

2.2 瀏陽豆豉發酵過程中總多酚、總黃酮含量變化

按照1.2.3、1.2.4小節中所表述的方法進行標準曲線的繪制,得出蘆丁標準曲線為:y=0.029x+0.0187,R2=0.9909;沒食子酸標準曲線為:y=0.2553x+0.0024,R2=0.9812。

由于多酚與黃酮大量存在于大豆中,是重要的抗氧化活性成分,這類化合物具有抗動脈硬化、降低膽固醇、抗氧化等作用[23]。其含量的高低與抗氧化能力密切相關,通過測定黃酮、多酚的含量變化情況,可以探究豆豉發酵過程中抗氧化能力的變化的原因。具體變化情況見圖3。

圖3 瀏陽豆豉發酵過程中總多酚和總黃酮含量的變化

由圖3可知,未經發酵的泥豆也具有較高含量的多酚與黃酮,多酚含量在發酵前期(L0～L7)從(2.78±0.14) mg/g迅速增加至(4.26±0.21) mg/g,而在發酵中期(L7～L12F)總多酚含量變化較小,洗曲(L12S)后多酚含量明顯下降,這可能是由于洗曲導致部分水溶性多酚流失導致的[24]。發酵后期(渥堆),多酚的含量迅速增加,到第20 d時其含量為(5.76±0.21) mg/g,是未發酵時的2.07倍。此外,王露[25]篩選出的節桿菌和芽孢菌發酵番石榴葉時可引起可溶性多酚的大量釋放。而石聰等[10]分析不同階段的瀏陽豆豉中微生物的豐度發現洗霉前后微生物群差異較大,前發酵時期真菌為優勢菌,而后發酵期間酵母菌和芽孢桿菌等細菌開始大量繁殖,這可能是導致發酵中后期多酚含量增速提升的原因。

大豆中的黃酮包括多種物質,如花色苷、黃酮等。發酵過程中,除L1有小幅度增加外,總黃酮含量呈明顯的下降趨勢,且發酵早期下降速度較快,L5較未發酵大豆下降了25.25%,而發酵后期(L12S～L20)出現緩慢上升的趨勢,從0.790 mg/g增加至0.881 mg/g,但無明顯差異。前期快速下降原因可能部分不穩定的黃酮類化合物分解,接下來微生物大量繁殖,大豆異黃酮次級代謝產物開始生成,維持總黃酮含量的平衡,同時微生物產生的β-葡萄糖苷酶將大豆異黃酮中的糖苷型異黃酮轉為苷元型[26-27],由于后者具有更強的抗氧化活性,導致豆豉抗氧化活性的增強。

2.3 瀏陽豆豉發酵過程中抗氧化活性的變化

圖4 瀏陽豆豉發酵過程中三種自由基清除率和總抗氧化能力的變化

2.4 抗氧化活性與多酚、大豆異黃酮的相關性分析

表3 總多酚、苷元型大豆異黃酮含量與自由基清除率和總抗氧化能力的相關性分析

3 結論