基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌雙重PCR檢測方法的建立

胡元慶,林凱玲,周贊虎,李鳳霞

(1.閩南師范大學生物科學與技術學院,福建漳州 363000;2.漳州海關綜合技術服務中心,福建漳州 363000)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是弧菌科弧菌屬的一種革蘭氏陰性菌,1950年由Tsunesaburo Fujino[1-2]從一名食物中毒患者體內首次分離。該菌廣泛分布于海洋和鹽湖中,是海產品中常見的致病菌,食物中毒病例臨床上以急性發病、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀[3-4]。近年來由VP引起的食物中毒已超過沙門菌食物中毒而躍居首位[5]。由于我國是海產品生產和消費大國,VP是食物中毒和沿海地區夏秋季腹瀉的主要病因[6],必須建立快速、準確、高效的檢測方法來監測海產品中的副溶血弧菌[7]。

檢測副溶血弧菌有分子生物學和分析化學法,操作步驟繁瑣[8],檢測周期較長。目前PCR技術已在VP檢測中得到廣泛應用,包括常規PCR[9-10]、實時熒光定量PCR[11-13]、EMA-PCR[14]、納米PCR[15-16]等。雙重PCR因其操作簡單,所需設備在基層檢測機構均有配置,可以同時擴增兩條大小不同的片段,能保證較高的特異性[17]。

盡管許多靶向基因(tlh和atpA)被用作VP的種屬特異性標記,但其中一些基因在其他弧菌中共享相似的序列,降低了檢測方法的準確性和特異性[18]。近年來有研究發現副溶血弧菌中有一種toxR致病基因,參與了某些毒力基因的轉運和表達[19],該基因在副溶血弧菌的種內相對保守[20-22],比tlh有更高的特異性[23]。blaCARB-17基因與副溶血弧菌對青霉素的固有抗性有關[18,24]。Li等分析了tlh、atpA和blaCARB-17基因的同源性,基于blaCARB-17基因的PCR特異性為100%,而基于tlh和atpA基因的PCR偶爾會出現假陽性結果[18]。blaCARB-17基因存在于GenBank已經登錄的所有293種副溶血弧菌株中,并且所有來源于食品的91株副溶血弧菌攜帶該基因[18,24],進一步證實了該基因比tlh、atpA基因更為保守。blaCARB-17和toxR基因都具有很高的特異性,普遍存在于各種來源的副溶血弧菌中。國內研究數據顯示,覃倚瑩等[25]2008年以toxR基因作為熒光定量PCR靶基因設計TaqMan探針快速檢測副溶血弧菌;白雪松等[26]2012年建立了tlh和toxR基因的雙重PCR檢測方法;張曉君等[27]2012年建立了基于toxR基因的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測病原性副溶血弧菌的方法;黃晨陽等[28]2013年基于toxR基因建立了檢測副溶血弧菌的PCR方法;曹冬梅等[29]2013年建立了toxR和tdh基因的Taqman探針雙色熒光PCR檢測方法;慕艷娟等[9]2015年建立了以toxR-S為靶基因的副溶血弧菌PCR檢測方法。國外研究顯示,Kim等[30]1999年通過檢測toxR基因分析了副溶血弧菌;2008年Rosec等[31]比較了toxR和pR72H為靶基因的PCR;2016年Li[18]等首先建立了針對blaCARB-17的PCR檢測技術,目前還沒有以此基因建立其他檢測方法的相關報道。blaCARB-17作為一種新型的靶基因[21,32]適合設計多重PCR,這為建立雙重PCR奠定了良好的分子基礎。

在我國檢測副溶血弧菌的PCR方法中,大部分以tdh、tlh、trh為靶基因并鑒定菌株的毒性,而以tlh、tdh為靶基因的PCR擴增結果偶爾會產生假陽性的現象[18]。本文針對副溶血弧菌的blaCARB-17和toxR兩個基因合成特異性引物,建立了雙重PCR的檢測方法,以期為基層水產品的大批量安全檢測提供可行性方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對照菌株(包括副溶血弧菌ATCC17802、大腸桿菌D5、金黃色葡萄球菌CMCC26003、志賀氏菌B4、蠟樣芽胞桿菌63302、單核細胞增生李斯特菌54001和沙門菌50041) 均由漳州海關綜合技術服務中心微生物檢測室提供;56個副溶血弧菌分離株 分離于漳州市區的45株(花蛤17株、蟶17株、南美白對蝦2株、文蛤9株),龍海的蝦2株,東山的蝦1株,云霄的南美白對蝦7株,廈門的南美白對蝦1株;TCBS瓊脂和普通肉湯培養基 北京陸橋技術股份有限公司;Tris base 生物純,Biosharp公司;Regular Agarose G-10瓊脂糖 生物純,西班牙BIOWEST公司;2×Taq Master Mix和Trans 2K DNA Ladder 上海捷瑞生物工程有限公司;Gel Stain(10000×)核酸染料 北京全式金生物技術有限公司。

Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國Biometra公司;Red型凝膠成像系統 美國ProteinSimple公司;MIKRO 220R高速冷凍離心機 德國Hettich公司;BSM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;HSY-B-200恒溫振蕩搖床 金壇市鴻科儀器廠;DYY-6D電泳儀 北京市六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物序列及合成blaCARB-17基因引物參考Li等[18]設計,toxR基因的引物參考Kim等[30]文獻設計,引物序列見表1,均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 擴增基因的引物序列

1.2.2 副溶血弧菌的培養 將副溶血弧菌ATCC17802接種于TCBS培養基,37 ℃恒溫培養箱培養24 h。挑取TCBS培養基上的單菌落,接種于3% 氯化鈉堿性蛋白胨水,37 ℃恒溫振蕩搖床培養12 h。對照菌接種到普通營養瓊脂上,37 ℃培養18～24 h;挑取單菌落接種于LB培養基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養18～24 h。

1.2.3 副溶血弧菌DNA的提取 移液槍吸取1.2.2中的菌液1 mL于1.5 mL離心管中,高速離心機12000 r/min離心5 min,去上清液,重復1～2次;移液槍吸取1 mL無菌水加入離心管并吹打,高速離心機12000 r/min離心5 min,去上清液;取100 μL無菌水懸浮沉淀;于沸水浴中加熱10 min;高速離心機12000 r/min離心5 min,取上清液(即副溶血弧菌DNA模板)到另一潔凈的離心管中,-20 ℃保存備用。

1.2.4 單重PCR檢測方法建立及反應條件的優化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作為模板,分別建立以blaCARB-17和toxR為靶基因的單重PCR。25 μL單重PCR體系為:12.5 μL的2×Taq Master Mix,上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O補足。優化退火溫度、退火時間和模板量等反應參數,確定最優的反應條件。

1.2.5 雙重PCR檢測方法建立及反應條件的優化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作為模板,建立以blaCARB-17和toxR為靶基因的雙重PCR。25 μL體系中,加12.5 μL的2×Taq Master Mix,兩對上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O補足。優化退火溫度、退火時間和引物比例等反應參數,確定最優的反應條件。

1.2.6 PCR產物的電泳檢測 配制1.5%電泳凝膠,在膠液中加入5 μL Gel Stain(10000×)電泳染料,制成電泳凝膠待用。取5 μL PCR產物上樣,98 V電泳35 min。電泳后凝膠于成像系統中成像并拍照。

1.2.7 特異性檢測 以大腸桿菌D5、金黃色葡萄球菌CMCC26003、志賀氏菌B4、蠟樣芽胞桿菌63302、單核細胞增生李斯特菌54001和沙門菌50041為對照,按照優化后的退火溫度、退火時間和引物比例進行PCR擴增,分析其特異性。

1.2.8 靈敏度檢測 將副溶血弧菌ATCC17802株用1.2.2的方法培養增菌,并進行10 倍梯度稀釋,然后用1.2.3的方法制備不同稀釋度菌液的基因組DNA。按上述優化后條件進行雙重PCR擴增,電泳確定其靈敏度。

1.2.9 人工污染樣品檢測 取1.2.8中的菌液1 mL均勻涂在樣品蝦的表面,放置4 h后,用1 mL無菌去離子水回收菌液,用1.2.3的方法制備基因組DNA。取1 μL DNA模板加入1.2.5已優化的反應體系進行PCR擴增,得出人工污染樣品的檢測限。

1.2.10 實驗室中副溶血弧菌分離株的驗證 采用本實驗建立的blaCARB-17基因的單重PCR和雙重PCR體系分別檢驗實驗室鑒定保存的56個副溶血弧菌分離株,驗證雙重PCR的穩定性。

2 結果與分析

2.1 單重PCR檢測方法建立及反應條件的優化

以副溶血弧菌標準株ATCC17802基因組DNA為模板,分別用特異性引物進行擴增,blaCARB-17和toxR基因均有清晰的條帶,大小分別為303、350 bp,見圖1。通過梯度PCR對退火溫度和時間進行優化,確定blaCARB-17基因最佳擴增條件:95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環擴增;最后72 ℃延伸5 min。toxR基因最佳擴增條件:95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環擴增;最后72 ℃延伸 5 min。模板最佳用量為3 μL。

圖1 單重PCR的擴增結果

2.2 雙重PCR檢測方法建立及反應條件的優化

首先梯度PCR優化了退火溫度和時間,然后對引物比例進行篩選,確定了副溶血弧菌的最佳雙重PCR的反應條件。以blaCARB-17和toxR基因建立的雙重PCR的最佳擴增條件:95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,25個循環;最后72 ℃ 延伸5 min。反應體系(25 μL):12.5 μL的2×Taq Master Mix,blaCARB-17基因上下游引物各1 μL,toxR基因上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,5.5 μL ddH2O。

圖2 雙重PCR的擴增結果

2.3 雙重PCR特異性檢測

應用上述體系對副溶血弧菌ATCC17802和6個對照菌株進行雙重PCR擴增,結果顯示副溶血弧菌擴增出303和350 bp雙條帶,其他6株對照菌均未出現任何擴增條帶(見圖3),表明所建立的副溶血弧菌雙重PCR檢測方法有很好的特異性。

圖3 雙重PCR的擴增結果

2.4 靈敏度檢測

由圖4可知,本實驗所建立的雙重PCR方法在濃度1×106～1×102CFU/mL均可以擴增出雙條帶,模板DNA為1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有單條帶(350 bp),表明本實驗雙重PCR方法檢測模板DNA的檢測限為1×102CFU/mL。該雙重PCR與很多學者報道的副溶血弧菌多重PCR檢測能力基本相當。胡元慶等[33]建立了檢測水產品中創傷弧菌和副溶血弧菌的雙重PCR方法,檢測限為1×102CFU/mL。蔣蔚等[34]建立的水產品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌多重PCR檢測方法,檢測限為1×102CFU/mL。桑燕嬌等[35]建立的副溶血弧菌和溶藻弧菌的雙重PCR檢測技術,檢測限為2×102CFU/mL。與趙現鋒等[36]建立的干燥型熒光PCR試劑盒的檢測限140 CFU/mL相當。虞艷等[37]建立的水產品中副溶血弧菌交叉引物恒溫擴增檢測技術的檢測限可達14 CFU/mL,與該技術的高靈敏性有關,但其反應所用的Bst DNA聚合酶價格較高。總之,本研究建立的雙重PCR不需要昂貴的儀器和試劑,檢測限完全滿足實際需要。

圖4 檢測副溶血弧菌純培養物的雙重PCR靈敏度

2.5 人工污染樣品雙重PCR檢測

由圖5可知,本實驗所建立的雙重PCR方法在濃度1×106～1×102CFU/mL均可以擴增出雙條帶,模板DNA為1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有隱約的單條帶,表明本實驗雙重PCR方法檢測人工污染樣品的檢測限為1×102CFU/mL。

圖5 雙重PCR檢測人工污染樣品的靈敏度

2.6 副溶血弧菌分離株檢測

對56個副溶血弧菌分離株進行blaCARB-17的單重PCR擴增及blaCARB-17和toxR基因的雙重PCR擴增,結果表明56個菌株可擴增出大小約為303 bp單條帶(結果見圖6)和350、303 bp的雙條帶(結果見圖7)。參考Li等[18]建立的blaCARB-17單重PCR,本研究成功對56株副溶血弧菌擴增到預期條帶,在此基礎上建立的雙重PCR也成功擴增到2條目的條帶,符合率100%,表明本實驗建立的雙重PCR方法準確可靠,無假陽性和漏檢情況。

圖6 blaCARB-17單重PCR的擴增結果

圖7 雙重PCR的擴增結果

3 結論

本實驗建立了以blaCARB-17和toxR為靶基因的雙重PCR方法,主要用于檢測水產食品中的副溶血弧菌，優化了雙重PCR的退火溫度、退火時間和引物比例等反應參數,檢測了雙重PCR的特異性和靈敏性,通過檢測人工污染樣品和副溶血弧菌分離株驗證了其穩定性。該雙重PCR最低檢測限為1×102CFU/mL,可特異地檢測食品中的副溶血弧菌污染。