基于非水溶性膳食纖維介質(zhì)的雙歧桿菌生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)及其抗逆性研究

陳翠翠,杭 鋒,張 灝,,李元昆,趙建新,陳 衛(wèi),陸文偉,,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;3.江南大學(xué)(揚(yáng)州)食品生物技術(shù)研究所,江蘇揚(yáng)州 225004;4.新加坡國(guó)立大學(xué)楊璐齡醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系,肯特區(qū) 119077)

雙歧桿菌最早是由法國(guó)學(xué)者Tissier從母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便中分離出來(lái)的一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。大量研究報(bào)道雙歧桿菌具有抗腸道致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等益生作用[1-2],被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健等領(lǐng)域。然而雙歧桿菌由于特殊的生理特性,極易在開(kāi)發(fā)益生菌制劑和儲(chǔ)藏過(guò)程中死亡,且經(jīng)人體胃腸道內(nèi)胃酸膽鹽的脅迫下,活菌數(shù)會(huì)驟然下降,限制了其對(duì)人體發(fā)揮有益的作用。真空冷凍干燥技術(shù)是制備高活性菌粉的最有效的一種干燥技術(shù),但凍干過(guò)程中仍會(huì)使菌體受到多種有害作用力,如凍結(jié)應(yīng)力、低溫應(yīng)力以及干燥應(yīng)力等,導(dǎo)致菌體活性下降[3-4];噴霧干燥技術(shù)可用于大規(guī)模的生產(chǎn)菌粉,但噴干過(guò)程中的高溫(100～200 ℃)和干燥脫水,會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞。目前大量研究主要集中在如何添加保護(hù)劑、優(yōu)化干燥工藝等方式來(lái)提高益生菌的抗逆性[5],對(duì)如何提高益生菌自身抗逆性卻報(bào)道甚少。

生物膜是由附著在生物或非生物表面的細(xì)菌及其自身分泌的細(xì)胞外聚合物基質(zhì)(extracellular polymeric substances,EPS)所形成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群落[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)超過(guò)99.9%的細(xì)菌都附著在不同材料表面的生物膜中生長(zhǎng)[8]。生物膜的形成阻止了細(xì)菌與有害物質(zhì)的直接接觸,提高細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性[9],據(jù)推測(cè),這可能是由于細(xì)胞外聚合物基質(zhì)的保護(hù)作用和生物膜細(xì)胞特有的群體感應(yīng)所致[10]。關(guān)于生物膜,近年來(lái)研究主要集中在如何去除病原菌的生物膜[11],對(duì)于如何利用生物膜增強(qiáng)益生菌的抗逆性的研究報(bào)道卻很少。張國(guó)麗等研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌生物膜形成后對(duì)溫度、酸堿、鹽度耐受性均有不同程度的提高[12]。蒲明珠驗(yàn)證基于椰果表面形成的乳酸菌生物膜相比于游離菌株,在人工胃腸道、高膽鹽環(huán)境下的存活率也顯著提高[13],Cheow等驗(yàn)證形成生物膜后的鼠李糖乳桿菌微膠囊,抗冷凍干燥能力提高了將近40倍[14]。眾多研究表明,利用益生菌生物膜提高其存儲(chǔ)穩(wěn)定性和抗逆性將在未來(lái)的工業(yè)化應(yīng)用上具有廣闊的前景。

生物膜的產(chǎn)生離不開(kāi)成膜基質(zhì),目前報(bào)道研究人員常用微孔板作為成膜載體[15],無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。成膜基質(zhì)的選擇必須遵循不溶于水,且符合食品添加標(biāo)準(zhǔn)的要求。非水溶性膳食纖維作為一種益生元,表面粗糙,成膜的比表面積大,并且可以大規(guī)模地發(fā)酵制備,是一種理想的成膜基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)研究了雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維上形成生物膜的能力,探究了雙歧桿菌最佳成膜時(shí)間,比較了生物膜成膜菌株和浮游菌株凍干存活率和對(duì)模擬胃腸液的耐受性,以期為益生菌生物膜在未來(lái)食品工業(yè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雙歧桿菌FJSWX25M1 江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù);牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、磷酸氫二鉀、無(wú)水乙酸鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸二氫鉀 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶(1∶10000)、胰蛋白酶(1∶250) Singma公司;膽鹽LP0055 Oxoid公司;黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維 興化市潤(rùn)宇食品有限公司。

EL3002型電子天平、FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LAB DANCER漩渦振蕩器 德國(guó)IKA公司;MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋 日本SANYO公司;厭氧工作站 Whitley 公司;ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái) 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;LYOBETA-5PS凍干機(jī) 西班牙Telstar公司;biotech-3000 5 L×3平行發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化和動(dòng)態(tài)生物膜培養(yǎng) 取活化三代后的雙歧桿菌以2%的接菌量接種到裝有50 mL mMRS液體培養(yǎng)基(添加0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基)的錐形瓶中,分別添加和不添加非水溶性膳食纖維(黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維),培養(yǎng)游離菌株和生物膜菌株,載體基質(zhì)添加量為20 g/L,固定培養(yǎng)基于搖床內(nèi),于37 ℃培養(yǎng)48 h,轉(zhuǎn)速為100 r/min,使載體基質(zhì)懸浮在培養(yǎng)基中而不沉降,讓菌體充分黏附于基質(zhì)上形成生物膜。

1.2.2 雙歧桿菌生物膜的發(fā)酵罐生產(chǎn) 取活化三代后的雙歧桿菌以5%的接菌量接種到3 L的發(fā)酵罐,分別添加和不添加非水溶性膳食纖維(葡萄籽粉和小麥纖維),培養(yǎng)游離菌株和生物膜菌株,載體基質(zhì)添加量為20 g/L,培養(yǎng)溫度37 ℃,調(diào)整發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為100 r/min,剛好使非水溶性膳食纖維顆粒不會(huì)沉降下去,充入氮?dú)馐构迌?nèi)氣壓達(dá)到0.1 MPa,分別厭氧培養(yǎng)12、24、36、48 h后取樣計(jì)算成膜活菌數(shù)和總活菌數(shù)。

1.2.3 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定成膜活菌數(shù) 成膜活菌數(shù)計(jì)數(shù)方法參考Ushakova等試驗(yàn)方法[16-17],吸取含有載體的發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL于2 mL EP管中,同一實(shí)驗(yàn)組分成兩份,一份于離心機(jī)中以100 r/min的轉(zhuǎn)速低速離心2 min,倒掉上清液,對(duì)麥麩上的活菌數(shù)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),根據(jù)麥麩所占體積計(jì)算,結(jié)果為成膜活菌數(shù)(CFU/mL,濕重);另一份培養(yǎng)液直接在旋渦振蕩器最大轉(zhuǎn)速攪拌10 min,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)結(jié)果為總活菌數(shù)(CFU/mL)。

1.2.4 雙歧桿菌生物膜的掃描電鏡微觀觀察 取發(fā)酵培養(yǎng)液100 r/min低速離心2 min,倒掉上清液,取生物膜載體顆粒,同時(shí)以空白載體作為對(duì)照,用含 2%(w/v)戊二醛溶液固定,取出樣品后用磷酸緩沖液漂洗2次,依次用50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐級(jí)梯度脫水,每次脫水時(shí)間為15 min。脫水完成后,自然風(fēng)干30 min,取適量樣品用導(dǎo)電粘膠粘貼在樣品臺(tái),噴鍍金粉,放入掃描電子顯微鏡中觀察[18]。

1.2.5 雙歧桿菌的凍干 凍干前樣品制備:發(fā)酵培養(yǎng)同1.2.2實(shí)驗(yàn)方法,培養(yǎng)36 h后提取發(fā)酵液,其中未添加載體的發(fā)酵液加入同等質(zhì)量滅菌后的載體,保持發(fā)酵液載體量一致,減小保護(hù)劑與菌泥比差異。發(fā)酵液于離心機(jī)8000×g,4 ℃,離心20 min,棄上清,收集菌泥,以1∶2 (w/v)的比例加入滅菌后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%脫脂乳保護(hù)劑,混勻進(jìn)行真空冷凍干燥。

凍干工藝為:預(yù)凍:預(yù)先將層板溫度在1 h內(nèi)降至-50 ℃,放入樣品,保持4 h;一次干燥階段:抽真空至最低真空度,設(shè)定 60 min 升高層板溫度至-30 ℃,保持此溫度恒定30 h;二次干燥階段:快速升溫至 20 ℃,并保持此溫度恒定 20 h[19]。

1.2.6 凍干存活率的測(cè)定 凍干前活菌數(shù)的測(cè)定:在凍干前留樣用于測(cè)定凍干前的活菌數(shù)。

凍干后活菌數(shù)的測(cè)定:添加PBS緩沖液還原到凍干前體積,混勻后平板菌落計(jì)數(shù)[20]。

1.2.7 凍干菌粉模擬胃腸液耐受能力的測(cè)定 模擬胃液:將胃蛋白酶溶于滅菌的0.85%(W/V)的生理鹽水中,用1 mol/L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0,使其濃度達(dá)到3 g/L,使用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

模擬腸液:將胰蛋白酶、膽鹽溶于滅菌的0.85%(W/V)的生理鹽水中,使其終濃度分別達(dá)到1 g/L和0.3%,用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0。使用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

取0.1 g菌粉溶于配制好的0.5%生理鹽水平板菌落計(jì)數(shù),作為脅迫處理前活菌數(shù);溶于配制好的模擬胃液培養(yǎng)2 h、模擬腸液培養(yǎng)4 h后進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù),作為脅迫處理后活菌數(shù)[21-23]。

存活率(%)=脅迫處理前活菌數(shù)/脅迫處理后活菌數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)三次所得,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SD)表示。采用Microsoft Excel 2016和Graphpad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,運(yùn)用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組數(shù)據(jù)的差異分析采用T檢驗(yàn)進(jìn)行判斷,差異顯著表示P<0.05。

2 結(jié)果和分析

2.1 雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維成膜情況的比較

為了探究雙歧桿菌在不同基質(zhì)上(黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維)形成生物膜的能力,通過(guò)計(jì)算生物膜活菌數(shù)和成膜率表征雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維基質(zhì)上的成膜情況(圖1),并做了相應(yīng)的掃描電鏡圖(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),如圖1所示,在葡萄籽粉上成膜活菌數(shù)、成膜率最高,分別為(1.98±0.13)×108CFU/mL和40.56%±2.64%。其次是小麥纖維成膜活菌數(shù)為(1.38±0.19)×108CFU/mL,成膜率為36%±3.55%。在玉米粉、筍干粉、黃豆粉表面,生物膜形成能力較差一些,在筍干粉表面,生物膜成膜活菌數(shù)最低,成膜能力最差。從圖2電鏡圖更加直觀得看到,在小麥纖維和葡萄籽粉上粘附的生物膜菌株最多,粘附能力最強(qiáng),而在其他幾種基質(zhì)表面上并不能很好的成膜,可以得出雙歧桿菌在不同基質(zhì)上形成生物膜能力并不一致。生物膜的形成需附著在生物或非生物材料表面[24],Grossova等[9]選擇不同的載體如馬鈴薯纖維,海藻酸鈉,燕麥纖維等固相基質(zhì)發(fā)酵益生菌,發(fā)現(xiàn)在不同基質(zhì)上形成生物膜能力并不一致,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。圖3為小麥纖維和葡萄籽粉空白載體的電鏡圖,可以看到葡萄籽粉具有多孔狀結(jié)構(gòu),Kathryn等[25]報(bào)道指出,表面粗糙的材料更易于生物膜的粘附。因此得出葡萄籽粉是雙歧桿菌FJSWX25M1最適宜成膜的載體。

圖2 雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維基質(zhì)上成膜的掃描電鏡圖片

圖3 葡萄籽粉(A)和小麥纖維(B)的掃描電鏡圖片

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)雙歧桿菌成膜情況的影響

為了探討雙歧桿菌FJSWX25M1最佳成膜時(shí)間,選擇葡萄籽粉和小麥纖維基質(zhì)作為粘附載體,使用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)生物膜,分別在12、24、36、48 h計(jì)算雙歧桿菌成膜活菌數(shù)以及成膜率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株在36 h時(shí)基于葡萄籽粉基質(zhì)的成膜率最高為36.68%±2.75%,成膜活菌數(shù)為(1.78±0.18)×108CFU/mL;而以小麥纖維為基質(zhì)形成生物膜時(shí),在24 h成膜率最高為33.39%±0.87%,此時(shí)成膜活菌數(shù)達(dá)到(1.42±0.13)×108CFU/mL。雙歧桿菌因粘附材料的不同,生物膜最佳成膜時(shí)間也并不相同。生物膜的形成由于受到微生物和粘附基質(zhì)的物理化學(xué)相互作用以及附著材料的表面性質(zhì)的影響[26],致使菌株在不同載體最佳成膜時(shí)間并不一致。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)雙歧桿菌成膜的影響

2.3 生物膜形成對(duì)雙歧桿菌凍干存活率的影響

生物膜細(xì)菌在不利環(huán)境條件下,會(huì)通過(guò)自身分泌的EPS聚合在固體表面,阻止了細(xì)菌與有害物質(zhì)的直接接觸,提高對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性[9]。為了探究生物膜菌株和浮游菌株凍干耐受性的差異,通過(guò)不同發(fā)酵時(shí)間形成的生物膜菌株跟浮游菌株凍干存活率的比較(如表1),發(fā)現(xiàn)以小麥纖維和葡萄籽粉為載體形成的生物膜菌株凍干后的存活率明顯高于浮游菌株,以葡萄籽粉為載體形成的雙歧桿菌生物膜發(fā)酵培養(yǎng)36 h后的凍干存活率最高,可達(dá)到35.65%±2.26%,浮游菌株凍干存活率僅為5.51%±0.71%,提高了6.5倍(P<0.01)。而以小麥纖維為載體形成的雙歧桿菌生物膜發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的凍干存活率最高,為29.89%±5.12%,較浮游菌株凍干存活率7.43%±0.73%提高了4倍(P<0.01)。

表1 生物膜菌株和游離菌株凍干存活率的變化

2.4 生物膜形成對(duì)雙歧桿菌模擬胃腸液耐受性的影響

比較游離菌株和生物膜菌株對(duì)模擬胃腸液耐受性,結(jié)果如表2所示,游離菌株的模擬胃液和腸液存活率分別為10.1%±1.48%和1.07%±0.22%,而以葡萄籽粉和小麥纖維為載體形成的生物膜菌粉,其模擬胃液存活率分別提高了5.9倍和5.1倍(P<0.01),存活率達(dá)到59.82%±2.32%和51.98%±2.73%,模擬腸液提高了12.6倍和10倍,存活率達(dá)到13.53%±1.5%和10.75%±3.29%,由此可見(jiàn),生物膜狀態(tài)下的雙歧桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受性顯著增加,Grossova等[9]研究結(jié)果表明,形成生物膜后的乳桿菌比游離菌株的耐酸耐膽鹽能力顯著增強(qiáng),本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論與其基本一致。

表2 生物膜菌株和游離菌株模擬胃腸液存活率的變化

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較雙歧桿菌在6種非水溶性膳食纖維的成膜情況,得出雙歧桿菌在葡萄籽粉上的成膜能力最強(qiáng),其次是在小麥纖維上。另外發(fā)現(xiàn)基于不同載體的最佳成膜時(shí)間并不一致,基于葡萄籽粉最佳成膜時(shí)間為36 h,基于小麥纖維最佳成膜時(shí)間為24 h。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌形成生物膜后其耐受性顯著提高,凍干存活率提高4～6.5倍(P<0.01),模擬胃液耐受性提高5.1～5.9倍(P<0.01),模擬腸液存活率提高10～12.6倍(P<0.01)。研究結(jié)果表明雖然雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維上形成生物膜能力和成膜時(shí)間不同,形成生物膜后其抗逆性均顯著提高,這一研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)抗逆性益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)。