五味子醇提物對TNBS致小鼠腸道炎癥的損傷修復(fù)作用

武曉英，李 博，曹貴東，劉愛玲，劉桂蘭，劉 地，李 娜，郝雪峰，喬宏萍

(1. 太原師范學(xué)院生物系，山西 晉中 030619；2. 山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西 太原 030032；3. 天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津 濱海新區(qū) 300308)

腸炎在畜禽養(yǎng)殖中發(fā)病率很高，目前抗生素類藥物是主要治療方法，但這些藥物的使用經(jīng)常導(dǎo)致畜禽腸道菌群失調(diào)，治療效果并不理想，而且抗生素的殘留問題對環(huán)境和人類健康都存在潛在風(fēng)險[1]。中草藥在中國有著幾千年的傳承，其藥效顯著，已有大量的研究證明，中草藥的有效成分可以增強腸黏膜的抗炎效應(yīng)，對腸道炎癥起到治療作用[2-3]。因此，本試驗采用五味子醇提液對2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)腸炎模型小鼠進(jìn)行治療效果觀察，為找到更安全有效的腸炎治療辦法提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TNBS，購自美國Sigma公司；血清促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、抑制炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(Interleukin-10，IL-10)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-a，TNF-α)檢測試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；組織細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α檢測試劑盒，均購自上海西唐生物科技有限公司；血清及組織抗氧化指標(biāo)總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、總抗氧化力(Total antioxidation capacity，T-AOC)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高壓滅菌鍋，日本松下電器公司；全波段酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗動物 SPF級雌性昆明系小鼠18只，4～5周齡，體重20～22 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 五味子醇提物的制備 五味子中藥粉碎后稱取50 g裝于1 000 mL圓底燒瓶中，用95%乙醇浸泡過夜(藥材與水的體積比1∶7)，次日，電熱套加熱微沸冷凝循環(huán)持續(xù)4～6 h，加熱結(jié)束后6 000 r/min離心，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，即藥液濃度為1 g/mL生藥，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 試驗設(shè)計 18只小鼠隨機分為3組，每組6只，稱重記錄，分別為對照組(C組)、致病組(TNBS組)和治療組(S+TNBS組)。

小鼠腸炎模型建立：將小鼠預(yù)飼1周，試驗前禁食24 h，自由飲水，采用灌腸法處理。TNBS組和S+TNBS組按每只小鼠5%TNBS[0.2 mL/(100 g·bw)]+50%乙醇(0.25 mL)進(jìn)行灌腸，每周1次，連續(xù)處理4周。C組小鼠按生理鹽水[0.2 mL/(100 g·bw)]+生理鹽水(0.25 mL)進(jìn)行灌腸。

中藥治療：造模4周后，S+TNBS組每只小鼠灌胃1 g/mL五味子醇提液0.2 mL，TNBS組和C組小鼠灌胃生理鹽水，自由采食飲水0.2 mL，連續(xù)處理10 d。末次給藥后給水禁食24 h，采用摘眼球法取小鼠血樣凍存于-20 ℃冰箱以測定細(xì)胞因子和抗氧化性能。

1.4.3 小鼠血清、腸組織細(xì)胞因子含量測定 ELISA雙抗夾心法檢測血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。ELISA雙抗夾心法檢測腸組織中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量。腸組織制備勻漿液，用PBS緩沖液反復(fù)清洗小鼠腸組織樣品，稱取0.5 g組織樣加生理鹽水5 mL進(jìn)行勻漿，離心沉淀收集上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 小鼠血清、腸組織抗氧化指標(biāo)檢測 除血清外，腸組織制備成10%的組織勻漿，4 ℃下15 000 r/min離心15 min，取上清液檢測T-SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA含量，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗采用單因素方差分析并進(jìn)行Duncan法多重比較，數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件分析，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組小鼠生理體征變化及剖檢病理觀察 小鼠生理體征變化：造模前，小鼠機體健康，精神狀態(tài)良好，排便正常；造模過程，每隔7 d采用TNBS/乙醇法對TNBS組和S+TNBS組小鼠進(jìn)行灌腸處理，處理4次28 d后TNBS組和S+TNBS組小鼠出現(xiàn)身體弓背蜷縮、活動減少、食量減少、大便溏且排血便。對照組小鼠采用生理鹽水灌腸后飲食、活動正常；中藥治療過程，4周后，S+TNBS組小鼠灌胃五味子醇提液，TNBS組和C組小鼠灌胃生理鹽水，在治療的10 d中，S+TNBS組小鼠進(jìn)食和飲水逐步增加，精神好轉(zhuǎn)，便溏改善，無血便，S+TNBS組較TNBS組有較大的改觀，但是同正常C組相比仍體質(zhì)虛弱。

小鼠剖檢觀察：試驗結(jié)束后剖檢小鼠，肉眼觀察腸道組織形態(tài)變化。C組小鼠腸道組織形態(tài)完整，無水腫，無出血；TNBS組小鼠腸道組織變形、腸管狹窄，伴有腸組織潰瘍和出血；S+TNBS組小鼠經(jīng)五味子醇提物灌胃治療后，其腸道組織形態(tài)較完整，輕微水腫現(xiàn)象，無潰瘍，無出血，與TNBS組相比損傷癥狀有明顯的減緩作用。

2.2 五味子醇提物對腸炎小鼠血清中細(xì)胞因子分泌的影響 見表1。由表1可知，TNBS組血清中促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著高于S+TNBS組(P<0.05)，極顯著高于C組(P<0.01)，S+TNBS組顯著高于C組(P<0.05)；S+TNBS組IL-10的含量極顯著高于TNBS組(P<0.01)，顯著高于C組(P<0.05)。

表1 不同處理組小鼠血清中細(xì)胞因子分泌的比較Table 1 Comparison of cytokine secretion in serum of mice in different treatment groups

2.3 五味子醇提物對腸炎小鼠血清抗氧化性能的影響 見表2。結(jié)果顯示，經(jīng)五味子醇提物治療后，S+TNBS組血清中T-SOD的含量極顯著高于C組和TNBS組(P<0.01)，TNBS組顯著高于C組(P<0.05)；小鼠血清中GSH-Px和T-AOC的含量S+TNBS組極顯著高于C組(P<0.01)，顯著高于TNBS組(P<0.05)，TNBS組顯著高于C組(P<0.05)；S+TNBS組血清中MDA的含量顯著低于TNBS組(P<0.05)，顯著高于C組(P<0.05)，C組極顯著低于TNBS組(P<0.01)。

表2 不同處理組小鼠血清抗氧化性能的比較Table 2 Comparison of serum antioxidant properties of mice in different treatment groups

2.4 五味子醇提物對腸炎小鼠腸組織細(xì)胞因子分泌的影響 見表3。由表3可知，經(jīng)五味子醇提物治療后，小鼠S+TNBS組腸組織中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著低于TNBS組(P<0.05)，但顯著高于C組(P<0.05)，TNBS組極顯著高于C組(P<0.01)；S+TNBS組腸組織中IL-10的含量極顯著高于TNBS組(P<0.01)，顯著高于C組(P<0.05)，C組顯著高于TNBS組(P<0.05)。

表3 不同處理組小鼠腸組織中細(xì)胞因子分泌的比較Table 3 Comparison of cytokine secretion in intestinal tissues of mice in different treatment groups

2.5 五味子醇提物對腸炎小鼠腸組織抗氧化性能的影響 見表4。結(jié)果顯示，經(jīng)五味子醇提物治療后，比較不同試驗組腸組織中T-SOD的含量，S+TNBS組極顯著高于C組和TNBS組(P<0.01)，TNBS組顯著高于C組(P<0.05)；S+TNBS組腸組織中GSH-Px和T-AOC的含量極顯著高于C組(P<0.01)，顯著高于TNBS組(P<0.05)，C組顯著低于TNBS組(P<0.05)；S+TNBS組腸組織中MDA的含量極顯著低于TNBS組(P<0.01)，顯著高于C組(P<0.05)，C組極顯著低于TNBS組(P<0.01)。

表4 不同處理組小鼠腸組織中抗氧化性能的比較Table 4 Comparison of antioxidant properties in intestinal tissues of mice in different treatment groups

3 討論

腸道是機體免疫水平最高的重要器官，腸炎的發(fā)生主要與腸黏膜屏障損傷相關(guān)，各種致病因素通過刺激腸道發(fā)生組織病變[4]。TNBS和乙醇混合法是通用的動物腸炎造模方法之一，該方法一方面活化并釋放促炎癥因子TNF-α促使NO的生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，形成潰瘍；另一方面TNF-α加速白細(xì)胞介素IL-1β、IL-2、IL-8等的釋放，從而導(dǎo)致腸黏膜屏障的損傷[5]。中草藥能夠通過調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)緩解炎癥反應(yīng)[6-11]。已有的研究證實，中草藥五味子對于治療腹瀉、疲勞、失眠和神經(jīng)衰弱等病癥具有很好的療效[12]。近年來不少研究者在臨床上應(yīng)用五味子配伍的四神丸治療腹瀉型腸易激綜合征取得了顯著療效[13]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，四神丸對脾虛小鼠具有腸道菌群調(diào)整及促進(jìn)損傷腸組織恢復(fù)的作用[14]。但五味子作為四神丸中的重要配伍成分，其作用機理尚未明確。Tsujikawa T等[15]通過檢測TNF-α水平變化來評估TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型中炎癥程度及藥物治療的效果。因此本試驗使用TNBS進(jìn)行小鼠腸炎造模，通過檢測TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β四種細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)來揭示五味子醇提液對TNBS型腸炎的作用機制，試驗結(jié)果顯示，TNBS致小鼠腸炎經(jīng)五味子醇提物治療后，S+TNBS組小鼠腸道損傷雖不能完全恢復(fù)到和C組小鼠一致，但小鼠血清與腸組織中細(xì)胞促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著低于TNBS組(P<0.05)，抑制炎癥的細(xì)胞因子IL-10的含量極顯著高于TNBS組(P<0.01)。本試驗結(jié)果與前人一致[16-17]，證實五味子醇提物可以使促炎癥細(xì)胞因子分泌降低，抑制炎癥細(xì)胞因子分泌升高，有效促進(jìn)了損傷腸組織的恢復(fù)。

生物體通過自身防御系統(tǒng)來維持氧化還原平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，氧化應(yīng)激會使得組織和細(xì)胞內(nèi)蓄積大量活性氧(ROS)，進(jìn)而損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，造成機體功能障礙[18]。大量的研究表明，TNBS化學(xué)制劑能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的ROS，ROS破壞了細(xì)胞膜脂產(chǎn)生大量的MDA，干擾脂質(zhì)代謝平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織氧化損傷[19]。T-SOD和GSH-Px是機體清除氧化損傷所產(chǎn)生ROS的重要酶，MDA是膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，T-AOC可以用來檢測機體的抗氧化能力。本試驗采用TNBS法進(jìn)行小鼠腸炎建模，經(jīng)五味子醇提物治療后，無論血清或腸組織中，S+TNBS組小鼠的抗氧化能力明顯提高，小鼠剖檢腸道病理觀察與TNBS組相比炎癥損傷癥狀有非常明顯的減緩作用。本試驗闡明了五味子醇提物在濃度為1 g/mL時對TNBS致小鼠腸炎的損傷修復(fù)有較好的治療作用。