南京地區仔豬源志賀菌分離鑒定與耐藥性分析

陽巧梅，鄧小榮，譚德展

(1.邵陽職業技術學院生物工程系，湖南 邵陽 422004；2.湖南省祁陽縣畜牧水產局，湖南 永州 426100)

豬腹瀉性疾病成為養豬過程中主要的傳染性疾病之一，腹瀉性疾病可以危害不同日齡的豬，尤其對仔豬危害較大，感染率和死亡率均較高，其死亡率高達80%以上，給養豬業造成嚴重的經濟損失[1]。相關研究表明，引起仔豬腹瀉因素主要包括細菌性、病毒性、寄生蟲性和飼養管理不當等，臨床中致病性大腸桿菌、沙門菌、志賀菌及梭菌等細菌性腹瀉較為常見[2-3]。仔豬細菌性腹瀉具有廣泛的流行性、發病率和死亡率均較高、易產生耐藥性等特點，給診斷和防控帶來一定的困難[4-5]。志賀菌又稱為痢疾桿菌，該菌主要引起人和動物的腸道傳染病，主要以發熱、腹瀉及血便為主，嚴重者可導致毒血癥等，是重要的人獸共患病病原之一[6]。國內關于志賀菌引起豬、牛、羊等發病的報道逐漸增多[7-8]。志賀菌可能對養殖業存在潛在的威脅，應該引起重視。

本試驗從采集自南京地區養殖場中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份中分離得到52株致病性志賀菌，并對其進行血清型分布及耐藥性檢測，確定流行趨勢，為該地區致仔豬腹瀉志賀菌病的防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 南京地區養殖場中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份，進行志賀菌分離鑒定。

1.2 試劑與儀器 MAC培養基、XLD培養基、普通營養肉湯，均購自青島高科園海博技術有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司；志賀菌屬診斷血清制劑，購自蘭州生物制品研究所；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑公司；基因組 DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000 Marker，購自北京中科瑞泰生物公司；2×TaqMarker Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司；凝膠成像系統、多功能梯度PCR儀，均由美國ABI公司生產。

1.3 實驗動物 25 g左右昆明系小鼠350只，由本單位實驗動物中心提供。

1.4 細菌的分離與鑒定 采集的病料組織樣品，經處理后，接種于MAC培養基在37 ℃恒溫箱進行擴大培養，挑取MAC培養基上單個優勢菌落接種于XLD培養基上進行鑒別培養，挑取XLD培養基單個菌落進行純化培養后，革蘭染色鏡檢和生化試驗。

1.5 細菌生化試驗 按照說明書，將分離菌株調整菌液濃度為0.5個麥氏濁度，接種 ID32E腸道菌鑒定試條中培養，用全自動細菌生化鑒定系統進行細菌生化特性鑒定。

1.6 細菌PCR鑒定 參考文獻[6]，根據GenBank數據庫中志賀菌保守區基因序列，設計ipaH基因特異引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA，以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，其測序結果與GenBank數據庫中登錄參考株的基因序列進行同源性比較。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 致病性試驗 將分離菌株培養至對數期進行菌落計數，調整菌液濃度為108CFU/mL，每株分離菌株腹腔注射0.2 mL(108CFU/mL)，5只小鼠，對照組注射等量的無菌營養肉湯，攻毒12 h后，觀察小鼠發病情況并進行細菌分離鑒定，試驗期為7 d。

1.8 血清型鑒定 參照依據國家標準《GB 4789.5-2012食品安全國家標準食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》中的方法對臨床分離的志賀菌的血清型進行檢測。

1.9 藥敏試驗 藥敏試驗參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行，按照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷與耐藥性分析。

2 結果

2.1 細菌分離培養 疑似志賀菌分離菌株在MAC培養基上長出半透明、圓形、大小一致的桃紅色菌落；在XLD培養基上長出半透明、圓形、表面光滑的中等大小粉紅色或者無色的菌落。分離菌株革蘭染色為陰性、呈兩端略圓的短桿狀。分離的志賀菌的培養特性和形態學特征與國家標準《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗》中報道的基本一致。

2.2 分離菌株生化鑒定 疑似志賀菌的分離菌株均能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，硝酸鹽試驗、M.R.試驗、枸櫞酸鹽試驗和吲哚試驗均為陽性;尿素酶試驗和V-P試驗陰性。生化鑒定系統鑒定為志賀菌，評定結果合格率為97.9%～99.9%；通過統計采集的126份樣品中分離得到69株志賀菌。

2.3 細菌PCR檢測與測序 用志賀菌特異引物ipaH基因對分離的69株分離菌株均擴增出大約為620 bp大小的目的條帶(圖1)。測序結果顯示：69株分離菌測序結果與GenBank庫中登錄的12株志賀菌參考株基因序列的同源性在98.9%～100.0%。因而證實了69株分離菌為志賀菌。

圖1 分離菌株PCR鑒定結果Fig.1 PCR results of isolated strainsM:DL-2 000 DNA Marker； 1～9:分離菌株M:DL-2 000 DNA Marker； 1～9:Isolated strains

2.4 致病性試驗 分離菌株在攻毒后的2～3 d出現發病，精神沉郁、腹瀉，個別的出現死亡，對死亡的小鼠進行細菌鑒定，從體內分離到志賀菌，直到試驗結束(7 d)，對照組的小鼠健康存活。通過統計52株分離菌株使小鼠致死，因而證實了分離的52株分離菌株為致病性志賀菌。

2.5 血清型鑒定 結果由表2可知，分離的52株致病性志賀菌的血清型主要包括福氏志賀菌1a、1b、2b、3b四種血清型，其中福氏志賀菌1a血清型有16株、福氏志賀菌1b血清型有21株，分別占致病菌株的30.1%、40.4%，福氏志賀菌1a和 1b血清型為該地區志賀菌流行的主要優勢血清型。

表2 血清型鑒定試驗結果Table 2 Results of serotype identification test

2.6 藥敏試驗 結果由表3可知，分離的52株致病性志賀菌對阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、多西環素5種藥物耐藥率最高，耐藥率在80.8%～98.1%；對新霉素、慶大霉素、大觀霉素、多黏菌素4種藥物耐藥率在 53.8%～75.0%；對頭孢噻呋、頭孢曲松、氟苯尼考、環丙沙星、林可霉素5種藥藥物耐藥率在9.6%～40.4%。

3 討論

志賀菌是一種重要人獸共患病原菌，該菌可以引起多種動物的嚴重腹瀉和幼齡動物死亡，嚴重威脅人和動物健康[9]。國內關于牛、羊、豬等動物感染志賀菌的報道逐漸增多。文英[9]報道了從青海省定地區牛、羊、雞、豬新鮮的糞便中分離得到72株志賀菌，大部分具有致病性。張興民等[6]研究表明，從四川地區226份羔羊的糞便中分離得到54株志賀菌，不同血清型的志賀菌對小鼠具有致病性。說明了志賀菌在養殖業中流行。因此，在養殖過程中，應該對志賀菌的防控引起重視。本試驗表明，從南京地區養殖場中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份中分離得到69株志賀菌，分離率為54.8%(69/126)，通過人工感染小鼠試驗，驗證其致病性，其中52株為致病性志賀菌。說明該地區仔豬源志賀菌在廣泛流行，應該引起重視。因此，本試驗對分離的52株志賀菌的血清型及耐藥性進行檢測與分析。

表3 耐藥性結果Table 3 Results of drug resistance analysis

志賀菌是主要的革蘭陰性的胞內寄生菌，該菌主要包括福氏志賀菌、痢疾志賀菌、宋內氏志賀菌、鮑氏志賀菌4個血清群，在我國流行的主要以福氏志賀菌F2a、F3型為主，其中志賀菌1型在我國不同地區、不同養殖場流行[10-12]。本試驗研究表明，分離52株致病性志賀菌屬于4種血清，福氏志賀菌F1a和F1b血清型為地區流行優勢血清型，分別占致病菌株的30.1%、40.4%；與國內相關報道有一定差異性，也可能與地區有關，不同的地區其流行情況不同。

在豬養殖過程中，抗菌藥物不合理的使用，不僅導致了抗菌藥物對細菌產生很強的耐藥性，同時還造成嚴重藥物殘留，細菌的耐藥性可以通過多種途徑傳播給人類，嚴重威脅著人類的健康[11-13]。本試驗表明，分離52株致病性志賀菌對阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等9種藥物耐藥率在53.8%～98.1%；對頭孢噻呋、頭孢曲松、氟苯尼考等5種藥藥物耐藥率在9.6%～40.4%。說明了該地區分離的仔豬致瀉性志賀菌耐藥性嚴重。應該引起重視。與楊永珍等[7]、文英[9]、陳文希等[14]等報道的有一定的差異性，可能與抗菌藥物使用的頻率有關，還可能與感染的宿主有關。因此，當仔豬發生志賀菌腹瀉性疾病時，應該進行耐藥性分析，選擇敏感藥物進行合理使用，減少耐藥性的產生，提高治療效果，同時還要注意豬場環境的消毒。