中西藥聯合對小鼠巴氏桿菌病的防治效果試驗

牛金利，佘琳曼，李達怡，黃妙容，羅燕珊，黃錦杏，明月月，馬 驛，彭金菊

(廣東海洋大學農學院動物醫學系，廣東 湛江 524088)

巴氏桿菌(Pasteurella)是一種人獸共患病的病原菌，分布廣泛，是農場和野生動物主要呼吸系統感染病原體之一[1]。主要通過呼吸道和消化道感染，引發的疾病死亡率高，嚴重危害動物以及人類的健康[2]。中藥被廣泛應用于畜牧生產，歷史悠久，在防治畜禽疾病方面，其具有抗菌消炎、無殘留、不易產生耐藥性等優點[3]。抗生素一直被用于治療細菌感染性疾病。大量的臨床實踐及藥理研究表明，合理的中西藥聯合能夠提高療效，減少耐藥性以及毒副作用的產生，但中藥的化學成分相對復雜，藥理作用尚不明確，聯合使用不當可能會導致療效降低，副作用增多，嚴重時甚至危害生命[4]，因此需通過試驗觀察驗證中藥和中西藥聯用是否有效。為了篩選出抑菌活性高、安全、毒副作用小的藥物用于防治巴氏桿菌病，本試驗利用微量肉湯二倍稀釋法、微量肉湯稀釋棋盤法測定單藥和藥物聯合的體外抑菌效果，選取體外抑菌效果較好的中藥和抗生素，通過灌服給人工感染巴氏桿菌的小鼠，觀察單藥和聯合用藥對其防治效果，為以后聯合用藥的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 巴氏桿菌(C48-3)，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.2 中藥和抗菌藥 香附、黃連、山藥、山銀花、益母草、決明子，均購自湛江市中醫院。阿莫西林、硫酸新霉素、鹽酸多西環素、氟苯尼考、替米考星、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉，均購自深圳容金科技有限公司。

1.3 實驗動物 BALB/c小鼠200只，體重約25～35 g，雌雄各半，購自廣東醫科大學實驗動物中心。

1.4 菌液的制備 挑取適量的標準菌株粉末接種于鮮血瓊脂培養基，37 ℃培養箱中培養16～24 h后，挑取單個菌落接種于營養肉湯中，37 ℃培養16～24 h， 采用平板計數法用營養肉湯把細菌濃度稀釋至105CFU/mL。

1.5 中藥水提物的制備 采用水煎法提取中藥，將香附、黃連、山藥、山銀花、益母草、決明子等各味中藥分別加熱煮沸30 min，過濾，連續煎煮3次，冷卻，過濾，合并煎煮藥液，濃縮藥液至相當于含生藥1 g/mL。

1.6 抗菌藥藥液的制備 將阿莫西林、硫酸新霉素、鹽酸多西環素、氟苯尼考、替米考星、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉等分別配成1 280 μg/mL。

1.7 中藥對巴氏桿菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用試管二倍稀釋法[5]測定各個中藥對巴氏桿菌的MIC，取試管12支，于各試管中加入菌液和藥液，12支試管的中藥含量分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.196、0 mg/mL。37 ℃培養16 h觀察結果。37 ℃培養24 h后劃線于營養瓊脂培養基，37 ℃培養24 h觀察結果，沒有細菌生長且中藥濃度最小，即為該中藥對該菌株的MBC。

1.8 抗菌藥對巴氏桿菌MIC和MBC的測定 采用微量肉湯稀釋法[6]，測定各個抗菌藥對巴氏桿菌的MIC，取96孔板，于各孔中加入菌液和藥液，使每排12孔中的藥物含量分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL。37 ℃培養16 h觀察結果。MBC的測定方法與中藥MBC的測定方法相同。

1.9 中西藥聯合MIC和MBC的測定 選取對巴氏桿菌體外抑菌效果最好的中藥抗菌藥，采用棋盤法[7]測定其聯合后對巴氏桿菌的抑菌效果。

FIC≤0.5為協同作用；0.52為拮抗作用。

1.10 小鼠人工感染巴氏桿菌的防治試驗

1.10.1 試驗分組 將小鼠隨機分成5組，每組20只。給藥劑量由體外抑菌試驗測得的MIC、MBC確定。Ⅰ 組為感染細菌的陽性對照組；Ⅱ組為不感染細菌的陰性對照組；Ⅲ組為中藥香附組，預防組和治療組用量分別為25 mg/(g·d)和50 mg/(g·d)；Ⅳ組為抗菌藥恩諾沙星組，預防組合治療組用量分別為0.5 μg/(g·d)和1 μg/(g·d)；Ⅴ組為香附與恩諾沙星聯合組，預防組用藥量香附25 mg/(g·d)、恩諾沙星0.5 μg/(g·d)，治療組用藥量為香附50 mg/(g·d)、 恩諾沙星1 μg/(g·d)。其給藥方式均為灌服。

1.10.2 人工感染試驗 用營養肉湯將巴氏桿菌稀釋成所需濃度，通過皮下注射不同濃度的菌液0.1 mL，篩選能引起小鼠死亡的巴氏桿菌菌液的濃度，在感染后24 h內，能夠引起小鼠死亡率超過70%的最小菌液濃度選為攻毒濃度。試驗確定每只小鼠皮下注射濃度為103CFU/mL的細菌混懸液0.1 mL，陰性對照組每只小鼠皮下注射生理鹽水0.1 mL。治療試驗：攻毒當天灌服藥液，連續給藥3 d，停藥后觀察10 d；預防試驗：連續灌服藥物3 d后皮下注射菌液，自攻毒之日起連續觀察10 d。統計各組死亡小鼠的數量，按常規方法對病死小鼠進行剖檢，分離組織和體液中的細菌進行革蘭染色鏡檢，確定死亡原因。

1.10.3 防治效果評價 用保護率進行評價：

2 結果

2.1 單藥對巴氏桿菌的抑菌效果 不同藥物對巴氏桿菌的體外抑菌效果見表1、表2。由表1可知，香附和黃連對巴氏桿菌的抑菌效果最好，MIC均為25 mg/mL，香附的MBC為50 mg/mL，黃連的MBC為200 mg/mL。由表2可知，在供試的7種抗菌藥中，恩諾沙星對巴氏桿菌的抑菌效果最強，MIC為0.5 μg/mL，MBC為1 μg/mL。硫酸新霉素和替米考星對巴氏桿菌的抑菌效果也較好，MIC分別為0.5 μg/mL和2 μg/mL。選取恩諾沙星和香附進行下一步試驗。

表1 單味中藥對巴氏桿菌的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of single Chinese medicine against Pasteurella (mg/mL)

表2 不同抗菌藥對巴氏桿菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of different antibacterial agents against Pasteurella (μg/mL)

2.2 藥物聯合對巴氏桿菌的抑菌效果 選取抑菌效果最好的中藥香附與抗菌藥恩諾沙星進行聯合，恩諾沙星和香附聯用時，恩諾沙星用量為單獨用藥的1/2、香附用量為單獨用藥的1/16即能呈現抑菌效果，FIC指數=0.56，為累加作用，表明恩諾沙星和香附兩藥聯用時為相加作用，抑菌效果增強。

2.3 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌病的預防效果 選取香附和恩諾沙星及其聯合進行防治試驗。預防試驗結果見表3，攻毒后陽性對照組小鼠死亡20只，存活率為0%。灌服藥物組的小鼠死亡率與陽性對照組比較均降低；香附、恩諾沙星以及香附和恩諾沙星聯合對小鼠的保護率分別為10%、60%、70%。香附與恩諾沙星聯合組的保護率最高，對小鼠感染巴氏桿菌病的預防效果較好。

表3 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌的預防效果Table 3 Preventive effects of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.4 不同藥物的治療效果 各種藥物對小鼠感染巴氏桿菌病的治療效果見表4，攻毒后陽性對照組小鼠死亡20只，保護率為0%。灌服藥物組的小鼠死亡率與陽性對照組比較有所降低；香附、恩諾沙星以及香附與恩諾沙星聯合對小鼠的保護率分別為25%、75%、80%。香附與恩諾沙星聯合組的保護率最高，對感染巴氏桿菌病的小鼠有較好的治療效果。

表4 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌的治療效果Table 4 Therapeutic effect of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.5 病死小鼠的剖檢結果及細菌形態特征 剖檢病死小鼠可見皮膚、黏膜發紺；心臟脂肪有出血點及灰色壞死病灶，心包積液；肝臟出血；脾臟出血；腎臟出現水腫，有出血、淤血。

分離組織和體液中細菌進行鑒定，染色鏡檢為革蘭陰性、兩極濃染的短桿狀或球桿狀細菌，符合巴氏桿菌的形態特征。

3 討論

3.1 抗菌藥物對巴氏桿菌的體外抑菌效果 巴氏桿菌對新霉素、替米考星和恩諾沙星敏感，MIC分別為0.5 μg/mL、2 μg/mL和0.5 μg/mL，其中恩諾沙星的抑菌效果最好。劉紅玉等[8]通過檢測鵝源巴氏桿菌對16種常用抗菌藥的敏感性時發現，其對喹諾酮類抗生素高度敏感。胡澤兵[9]通過藥敏試驗發現分離的多殺性巴氏桿菌對恩諾沙星和新霉素高度敏感。張旭等[10]研究發現，替米考星對禽多殺性巴氏桿菌的MIC為2 μg/mL。中藥以香附、黃連的抑菌效果(25 mg/mL)最強。黃楠等[11]發現，四黃止痢顆粒方劑的6種中藥中黃連對多殺性巴氏桿菌的抗菌活性最強，MIC為1.563 mg/mL。香附具有鎮痛解熱、抗菌抗炎的功效。香附與恩諾沙星聯合用藥增強了抑菌效果。

3.2 藥物聯合對小鼠巴氏桿菌病的防治效果 本試驗中采用香附、恩諾沙星、香附和恩諾沙星聯用，治療和預防小鼠巴氏桿菌病的作用與陽性對照組相比有所提高。恩諾沙星對小鼠感染巴氏桿菌病的防治效果較好，保護率分別為60%和75%。馬驛等[12]研究發現，恩諾沙星對雞巴氏桿菌病的治療和預防效果較好，保護率分別為33.33%和70%。香附對小鼠巴氏桿菌病的防治效果不理想，保護率分別為10%和25%。香附和恩諾沙星聯合對巴氏桿菌病的預防和治療效果比單藥強，保護率分別為70%和80%。說明香附與恩諾沙星聯用在預防小鼠巴氏桿菌病中能夠降低巴氏桿菌對恩諾沙星的耐藥性，配合香附一起使用更充分發揮藥物的作用。

3.3 藥物聯合在疾病防治中的作用 抗生素一直是治療細菌性疾病的首選藥物，但抗菌藥具有毒副作用，易引發雙重感染，隨著抗菌藥的大量使用，細菌易出現耐藥性和藥物殘留，給人類健康造成威脅[13]。胡星星等[14]研究發現，分離的55株巴氏桿菌對臨床常用抗菌藥都產生了耐藥性。而中藥具有抗炎消炎，不易產生耐藥性的特點，重在提高機體的免疫能力，平衡機體的各項功能，還能提高其對抗生素的敏感性[15]。高艷等[16]發現，翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌具有良好的體內、外抑菌活性。中西藥的聯合使用在治療和預防巴氏桿菌病方面得到認可。由黃連、黃芩等中藥和氟苯尼考聯合，對鴨禽霍亂的防治效果明顯[17]。裴立峰[18]研究發現，中藥復方結合雙氟沙星、氧氟沙星等西藥對禽霍亂的治愈率達91.5%。這充分體現了中西藥結合的優勢，但其抑菌成分和機理不明確，盲目的使用和濫用，仍會使細菌產生耐藥性，降低療效。因此需對其進行深入的研究，合理進行藥物聯合。