基于雙探針雜交的雞心包積液綜合征病原檢測方法的建立與評估

鄭 鳴，郭宏偉，李華瑋，趙緒永，王老七，魏露露，王永芬

(河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046)

雞心包積液綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)是由禽腺病毒I群血清4型引起的高度傳染性疾病。1987年，該病首次發現于巴基斯坦安卡拉(Angara)地區，俗稱安卡拉病(Angara disease)，隨后在印度、加拿大、美國、韓國和日本等多個國家暴發流行[1-2]，自2015年開始，我國山東、山西、河南、河北、遼寧等地先后有心包積液綜合征疫情報道[3-4]，且呈逐年增強趨勢。雞心包積液綜合征主要發生在 20～30日齡肉雞中，可引起心包積水、嚴重肝炎，發病急，死亡率高；還可引起免疫抑制，造成疫苗免疫失敗，繼發新城疫、傳染性法氏囊病、大腸桿菌病等疫病[5-6]，加劇病情發展，給養禽業造成巨大的經濟損失。

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是無囊膜線性雙鏈DNA病毒，屬于腺病毒科(Adenoviridae)，是禽類常見的傳染性病原之一[7]。根據血清型不同可分為I、II、III亞群，其中I群禽腺病毒包括12個血清型，具有共同的群抗原[8]，大多數I群腺病毒對禽類的致病作用尚未確定，而研究者普遍認為血清4型腺病毒(FAdV-4)是引起雞心包積液綜合征的主要病原[9-10]。資料顯示，FAdV-4在中國的雞群中感染率很高，且多為隱性感染，一旦發生應激或感染其他疾病，即可引起呼吸道疾病、生長遲緩、產蛋下降等癥狀[11-12]，危害嚴重，建立一種快速、準確的病原學檢測方法就顯得尤為重要。

目前，針對FAdV-4的實驗室檢測方法主要有病毒分離、免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金紙條、熒光定量RT-PCR和環介導等溫擴增技術(LAMP)等[13-14]。病毒分離準確度高，但操作復雜，診斷時間長，不適合快速診斷；基于抗原抗體反應的免疫學診斷技術，操作簡單，檢測時間短，但因病原血清型眾多、抗原變異快，檢測準確度和靈敏度低，重復性不好；基于核酸擴增的分子診斷技術，直接針對核酸檢測，特異性強，準確度高，但由于檢測易污染且對核酸完整性要求高而導致檢測結果不理想，限制了分子診斷技術的推廣應用。六鄰體(Hexon)是FAdV-4衣殼蛋白，與致病性密切相關，包含主要種屬特異性抗原決定簇，是中和抗體重要靶標，六鄰體(hexon)基因也是FAdV-4的分子診斷主要靶基因[15]。本試驗根據GenBank 數據庫中FAdV-4的hexon基因序列保守性及分子進化特點，設計特異性雙探針，通過雜交、單鏈置換和PCR擴增，建立FAdV-4環介導PCR檢測技術，旨在為雞心包積液綜合征的病原學診斷和流行病學調查提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、毒株及病料 TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司；耐熱連接酶，購自英國NEB公司；高保真酶Pfu和DL-2 000，均購自寶生物工程(大連)有限公司。試驗所用活疫苗NDV、IBV、CIAV、IBDV、FPV，均購自中國獸醫藥品監察所；MDV，購自南京梅里亞動物保健品公司；H9N2亞型AIV、FAdV-4和FAdV-11尿囊液由本實驗室鑒定保存；質粒pMD18-T-Lectin由本實驗室構建保存。試驗用103份雞的肝臟、脾臟、腎臟等病料由河南牧業經濟學院禽病研究所收集自鄭州市周邊縣市養雞場，-80 ℃ 凍存。

1.2 雙探針設計及引物合成 以GenBank 收錄的FAdV-4六鄰體hexon基因(KU877432.1)為參考，采用MegAlign軟件分析hexon基因的保守性及進化特征，選取2段長度為10～20 bp、序列相鄰的保守區作為雜交雙探針，Blastn在線分析特異性。試驗中用到的雙探針、標記引物和檢測引物序列見表1，利用Primer Premier 6.0軟件設計，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 雙探針、標記引物和檢測引物序列及特性Table 1 The sequences and properties of labeling primers，detection primer and dual-probe

1.3 核酸的分離 DNA制備：病毒DNA、病料基因組DNA分離按參考文獻[23]進行。RNA制備：病毒RNA、病料總RNA則采用TRIzol試劑方法，具體操作按照說明書進行。分離的核酸樣品于-80 ℃保存備用。

1.4 雙探針標記報告基因 以重組質粒pMD18-T-Lectin為模板，以F-1、R-1為引物對，采用PCR擴增大豆Lectin基因片段，制備雙探針標記的報告基因，50 μL PCR反應體系包括：5×Pfu Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL，F-1和R-1(10 μmol/L)各1 μL， 重組質粒pMD18-T-Lectin 0.5 μL，高保真Pfu(5U/μL) 0.25 μL，加ddH2O補足50 μL；反應條件依次為：預變性5 min后，進行循環94 ℃ 30 s→ 60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，擴增35個循環。2%凝膠電泳檢測，膠回收產物，獲得FAdV-4雙探針標記的報告基因，保存-20 ℃冰箱備用。

1.5 環介導PCR檢測方法建立 根據試驗設計，采用一步法進行環介導PCR檢測試驗，即在同一反應管中依次進行雙探針雜交識別目的基因、單鏈置換和反向PCR擴增，50 μL反應體系包含：10×Pfu Buffer 5 μL，10×Ligase Buffer 5 μL，高保真Pfu(5U/μL) 0.5 μL，耐熱連接酶 0.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L) 1～2 μL，報告基因各1～3 μL，檢測引物 F-2和R-2(10 μmol/L)各0.5～1 μl，病毒核酸2 μL。 循環條件依次為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s →50～60 ℃ 3 min，10個循環；95 ℃ 50 s→50～60 ℃ 50 s→72 ℃ 50 s，25個循環。產物經2%凝膠電泳檢測與克隆測序驗證，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.6 特異性試驗 分別以FAdV-4、FAdV-11、NDV、CIAV、IBDV、IBV和MDV的核酸樣品為模板，采用方法1.5中反應體系及循環條件分別進行環介導PCR擴增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況，評估方法的特異性。

1.7 靈敏度試驗 用NanoDrop超微量分光光度計對 FAdV-4核酸樣品進行濃度及純度分析，并用無菌ddH2O調整核酸濃度至1.0 ng/μL，再進行2倍倍比稀釋，依次形成核酸濃度(pg/μL)為500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.85 和3.93共8個梯度樣品，分別進行環介導PCR擴增，觀察電泳結果，確定檢測的最低核酸濃度。

1.8 臨床樣品比較檢測 采用方法1.3抽提103份供試臨床病料基因組DNA，分別進行常規PCR、環介導PCR和SYBR Green PCR檢測FAdV-4病原，觀察檢測結果，計算3種方法對FAdV-4的陽性檢出率；同時利用統計分析軟件SPSS13.0進行Kappa檢驗，比較分析環介導PCR和實時PCR檢測的敏感性、特異性和一致性。

2 結果

2.1 雙探針標記報告基因的制備 以F-1和R-1為引物，采用常規PCR擴增質粒pMD18-T-Lectin，獲得特異性雙探針標記的報告基因Lectin，電泳檢測發現在Marker 250～500 bp之間有1條清晰條帶，擴增片段大小與392 bp的預期片段相一致(圖1)。

圖1 Hexon 雙探針標記報告基因制備Fig.1 Preparation of reporter genes labeled with dual- probes for Hexon geneM:DNA分子量標記DL-2 000； 1:陰性對照；2:Hexon雙探針標記的報告基因M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control;2:Reporter gene labeled with dual-probes for Hexon gene

2.2 環介導PCR檢測FAdV-4 根據試驗原理以及探針、報告基因和檢測引物的設計情況，環介導PCR擴增FAdV-4基因產物大小應為362 bp。電泳結果(圖2)顯示，FAdV-4樣品有1條清晰的特異性擴增條帶，條帶位置在Marker 250～500 bp，與預期大小一致，而陰性對照樣品則未見明顯擴增；膠回收上述特異性條帶，經T/A克隆和測序分析，結果顯示，上述擴增片段中包含一段40 bp FAdV-4Hexon基因片段，兩側則為大豆Lectin基因片段，與設想完全符合。

圖2 環介導PCR檢測FAdV-4結果Fig.2 The result of detecting FAV-4 by loop-mediated PCRM:DNA分子量標記DL-2 000； 1:陰性對照；2:FAdV-4M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control; 2:FAV-4

2.3 特異性試驗 采用方法1.5，按優化后的循環體系及條件分別對FAdV-4、FAdV-11、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等樣品進行環介導PCR擴增，結果發現，僅有FAdV-4樣品可見特異性擴增條帶，而其他病毒核酸樣品和陰性對照樣品未見明顯擴增(圖3)，表明該檢測方法特異性好，且與其他病原無交叉反應，可有效檢測FAdV-4病毒。

2.4 靈敏度試驗 靈敏度試驗結果(圖4)表明，經倍比稀釋后的FAdV-4核酸樣品中，有7個濃度的核酸樣品可見特異性擴增，條帶亮度隨核酸濃度的降低而逐漸減弱，當核酸濃度低至3.93 pg/μL時則無法觀察明顯條帶。結果表明，所建立的FAdV-4環介導PCR檢測方法靈敏度高，可檢測的最低極限核酸濃度為7.85 pg/μL。

圖3 特異性試驗Fig.3 The results of specificity assayM:DNA分子量標準DL-2 000； 1～8：陰性對照、FAdV-4、FAdV-11、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDVM:DNA Marker DL-2 000; 1～8:Negative control,FAdV-4,FAdV-11,NDV,IBDV,CIAV,IBV,MDV

圖4 靈敏度試驗Fig.4 The results of sensitivity assayM:DNA分子量標記DL-2 000； 1：陰性對照； 2～9：FAdV-4核酸濃度(pg/μL)分別為500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.85和3.93M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control；2～9:Concentration of nucleic acids (pg/μL) of FAV-4 was 500,250,125,62.5,31.3,15.7,7.85 and 3.93,respectively

2.5 臨床樣品比較檢測 利用常規PCR、環介導PCR和實時PCR 3種方法分別對103份疑似病料DNA進行了比較檢測。結果如表2所示，在103份病料DNA中，常規PCR、環介導PCR和實時PCR分別檢出陽性33份、36份、37份，陽性檢出率分別為32.0%，35.0%和35.9%；環介導PCR對FAdV-4的陽性檢出率接近定量PCR，而高于常規PCR。采用Kappa值法分析環介導PCR和SYBR Green 實時PCR對103份疑似樣品檢測結果的一致性，結果如表3所示,環介導PCR對FAdV-4檢測的敏感度、特異度和準確度分別為97.30%、100%和99.03%，Kappa值為κ=0.98,表明環介導PCR對FAdV-4檢測的敏感度、特異度、準確度與SYBR Green 實時PCR相當，2種方法檢測結果高度一致。

表2 常規PCR、環介導PCR和SYBR Green實時PCR對臨床樣本FAdV-4檢出率比較Table 2 Comparison of the detection of FAV-4 infected clinical samples by conventional PCR,loop-mediated PCR and SYBR Green real-time PCR assays

表3 環介導PCR和SYBR Green 實時PCR對臨床樣本檢測的敏感性、特異性分析Table 3 Sensitivity and specificity of loop-mediated PCR compared with SYBR Green real-time PCR based on testing of 103 clinical samples

3 討論

現已證實，FAdV-4是引起雞心包積液綜合征的病原體，在雞群中普遍存在，早期致病性弱，病死率低而極少受到關注。但FAdV-4長期感染可造成免疫抑制，繼而易發與傳染性囊病、傳染性貧血、雞新城疫、馬立克病等病原的混合感染，致死率可達100%，給肉雞養殖業造成巨大經濟損失，目前尚無有效疫苗。由于FAdV 血清型眾多，加上多病原混合感染、病毒基因重排及毒力演變，致使病情復雜，給疫病防控造成了困難，必須通過實驗室檢測進行確診。

FAdV-4六鄰體hexon基因是被研究最廣泛的基因，編碼Ⅰ亞群腺病毒重要的結構蛋白，具有種屬特異性，既是中和抗體的靶標，也是基因檢測的靶標?；诓《净蚪M的高頻重組及變異性，作者分析hexon基因分子進化特點及序列特征，設計2條序列相鄰的左、右探針，分別標記于大豆Lectin基因片段兩端，獲得雙探針標記的報告基因(圖1)。檢測時，因特異性雙探針與待檢hexon基因雜交而將報告基因Lectin片段兩端拉近、相鄰，經連接后形成環狀報告基因，再采用1對反向引物F-2和R-2擴增環化報告基因，實現FAdV-4環介導PCR檢測。通過優化報告基因、酶、dNTPs和引物的用量，成功擴增出1條長度約為360 bp基因片段，序列分析發現，擴增片段中間含有40 bphexon雜交探針，與NCBI數據庫中FAdV-4Hexon基因序列同源性達99%以上，而兩側則為大豆Lectin基因序列。運用所建立的方法分別檢測FAdV-4、FAdV-4、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等病毒核酸樣品，僅有FAdV-4樣品能成功擴增出預期片段，條帶清晰，而FAdV-4、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等其他禽病原體則未見明顯擴增(圖3)，表明該方法特異性強，可有效區別檢測FAdV-4與其他常見的禽病原體，能檢出FAdV-4的最低核酸濃度為7.85 pg/μL(圖4)，靈敏度高。應用環介導PCR、常規PCR和SYBR Green 實時PCR 3種方法對103份疑似病料進行比較檢測，結果表明(表2)，3種方法對FAdV-4陽性檢出率分別為35.0%、32.0%、35.9%，表明FAdV-4在本省雞群中隱性感染現象比較普遍，提示安卡拉病毒依然在危害著本省雞群，由于FAdV-4感染可能會導致免疫抑制，增加其他病原的易感性，需要做好混合感染和繼發感染的針對性預防；環介導PCR對FAdV-4的陽性檢出率接近定量PCR，而高于常規PCR，分析原因在于，常規PCR采用特異性引物直接擴增目的基因進行檢測，對擴增模板的完整性要求較高，樣品新鮮程度、核酸降解與斷裂等情況都會影響擴增結果，而環介導PCR則是基于雙探針與目的基因雜交，雙探針長度僅為40 bp， 對模板完整性要求不高，核酸部分降解與斷裂對結果影響不大，檢測敏感性和特異性相對較高。采用Kappa檢驗法分析環介導PCR和實時PCR對103份臨床樣品檢測結果的一致性，發現2種方法對FAdV-4檢測結果的Kappa值為0.98，檢測結果高度符合，可以代替實時PCR應用于雞心包積液綜合征病原的臨床檢測。

4 結論

綜上所述，本試驗所建立的FAdV-4環介導PCR檢測方法，具有特異性強、敏感性高等優點，可用于臨床樣品FAdV-4的檢測，為心包積液綜合征病原學研究、快速檢測以及流行病學調查提供一種簡單、有效的方法。