食品中鴨源性成分的微滴數字PCR定量檢測方法的建立

張秀平，苗 麗，黃世英，蔡一村，羅寶正，鄭秋月，汪 琳，孔凡德

(1. 河南捷信檢測認證有限公司，河南 鄭州 450003 ; 2. 鄭州海關技術中心，河南 鄭州 450003;3. 鄭州市現代農業科技服務中心，河南 鄭州 450003 ; 4.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 浦東 200002 ；5. 拱北海關技術中心,廣東 珠海 519010 ; 6. 大連海關技術中心，遼寧 大連 116000;7. 北京海關技術中心,北京 朝陽 100023 ; 8. 廈門海關技術中心，福建 廈門 361001)

食品的質量和安全問題日益成為社會關注的焦點，而目前利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者而謀取暴利的事件屢屢出現，如將相對廉價的鴨肉深加工后冒充牛羊肉進行銷售[1]；其中，相對于豬肉，鴨肉的紋理色澤和牛羊肉最為接近，并且為彌補羊肉味不足，有的甚至摻入羊肉粉，羊肉精膏等添加劑來粉飾其摻假行為[2]。所以建立肉種鑒定中準確性高、操作性強且易于推廣的定量檢測技術是非常必要的。

隨著現代生物學的發展，食品中肉類成分的鑒別與分析已逐步形成了以蛋白質和核酸檢測為基礎的方法體系[3-5]。微滴數字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一門新的核酸擴增技術[6]，其將含有目的基因的PCR反應體系通過微滴發生器進行微滴化處理后進行PCR擴增。反應結束后，使用微滴檢測器對每個微滴逐個檢測，最終經分析軟件計算出DNA分子的濃度(拷貝/μL)[7]。與熒光定量PCR相比，數字PCR通過微滴化處理，將一個反應體系分成20 000個小反應體系，可有效避免雜質及非特異性片段的檢測干擾，解決擴增效率的問題，實現檢測的高分辨率和高靈敏度[8]，在肉源成分的少量摻雜檢測方面有廣闊的應用前景。且本方法無需依靠參照基因，可直接得出DNA拷貝數，已經廣泛應用于生命科學研究的各個領域，目前已經報道的主要有絕對定量、稀有突變檢測和拷貝數變異等[9-10]。

β-actin基因是肌動蛋白的一種單拷貝基因，具有基因序列高度保守、能在不同組織細胞中穩定表達特點[11-12]。本試驗根據鴨的單拷貝β-actin基因，設計鴨特異性引物、探針，利用微滴數字PCR技術，根據鴨的肉樣的質量與DNA含量的關系，以及DNA含量與拷貝數之間的關系，建立待檢樣品中鴨源成分的質量和拷貝數之間的關系，實現檢測肉制品中鴨源成分的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 生鮮鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鵝肉等肉樣；牛肉粒、牛肉干、牛肉松、羊肉卷、肥牛卷、烤羊肉串、牛肉丸等肉制品購自鄭州某農貿市場。

蛋白酶K(20 mg/mL)，TaKaRa公司；Tris-飽和酚、氯仿/異戊醇(24∶1)，北京索萊寶生物科技有限公司；組織裂解液(1 mol/L Tris-HCL、0.5 mol/L EDTA、10% SDS)、75%的無水乙醇為自配試劑。

1.2 儀器和設備 Bio-Rad QX200 ddPCR 微滴生成儀(美國Bio-Rad公司)；Senso Quest LabCycler梯度PCR儀(德國Senso公司)；DT500(感量0.001 g和0.1 g)電子天平(江蘇常熟長青儀器廠)；BioSpec-nano微量核酸蛋白儀(島津企業管理有限公司)；NTS-4000AM恒溫振蕩水槽(Tokyo Tikakikai)；Hermle Z36HK高速冷凍離心機(最高轉速12 000 r/min 以上) (哈默公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 將鴨肉或肉制品切成約1～2 cm2大小的肉丁，用蒸餾水洗凈，在10 ℃水中浸泡過夜，以除去多余的鹽分和油脂，用組織勻漿機絞碎后于烘箱中80～85 ℃烘干72 h，然后將烘干后的肉加入粉碎機中進行粉碎、勻質處理，得到預處理后的鴨肉樣品或待檢測肉制品。

1.3.2 DNA提取 采用酚/氯仿法提取樣品的基因組DNA，具體步驟參考文獻[13-14]進行，最后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，然后采用核酸定量測定儀測定提取肉樣的DNA含量。

1.3.3 引物和探針的設計 通過軟件DNAMAN對GenBank中公布的鴨、雞、牛、羊、豬等多個物種的β-actin基因序列進行比對，篩選出鴨β-actin特異序列，并用Primer 5.0軟件設計鴨源性成分的特異性引物和探針。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。詳細序列見表1。

表1 鴨源性成分微滴數字PCR的引物和探針Table 1 Primer and probe sequences for quantitative ddPCR assays

1.3.4 微滴數字PCR反應 反應體系：ddPCRTMSupermix for Probes (No dUTP) 10 μL，上下游引物各1.8 μL(900 nmol/L，探針0.5 μL(250 nmol/L)，DNA模板4 μL，用雙蒸水補齊至20 μL。通過微滴發生器進行微滴化處理后進行PCR反應。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，98 ℃ 10 min，40個循環。最后用微滴分析器對微滴進行分析。

1.3.5 引物與探針的特異性 為驗證所建微滴式數字PCR方法的特異性，將通過試劑盒測定的鴨肉陽性樣品作為陽性對照，以豬、牛、羊、雞、鴨、鵝等常見禽肉，以及小麥、玉米、水稻等植物樣品提取的DNA作為模板進行檢測。

1.3.6 標準曲線的建立

1.3.6.1 鴨肉質量與DNA濃度之間關系式的確定 稱量至少5個不同質量梯度的預處理的鴨肉樣品，提取DNA后測定每份樣品DNA濃度。根據測得的鴨肉樣品DNA濃度和與之相對應的鴨肉的質量，制作鴨肉樣品質量-鴨肉樣品DNA濃度的曲線，得到鴨肉樣品質量-DNA濃度的線性關系式：C1=k1m1+b1，其中，其中，C1代表提取得到的DNA濃度(ng/μL)，m1代表肉粉質量(mg)，k1為斜率，b1為截距。

1.3.6.2 鴨肉DNA濃度與基因拷貝數之間關系式的確定 對鴨肉樣品的DNA進行梯度稀釋，以不同系列濃度梯度的DNA樣品為模板，進行微滴數字PCR擴增。根據基因拷貝數和與之相對應的模板DNA含量，制作關于模板DNA含量-基因拷貝數的標準曲線，得到模板DNA含量-基因拷貝數的線性關系式：Y=k2C2+b2，其中，Y代表鴨特異性基因片段拷貝數濃度(拷貝/μL)，C2代表DNA溶液的濃度(ng/μL)，k2為斜率，b2為截距。

1.3.6.3 鴨肉樣品質量與基因拷貝數之間關系式的確定 根據dPCR檢測得到的反應體系中鴨肉特異性基因片段拷貝數濃度的平均值，利用建立的各標準曲線，按下式計算待測樣品中鴨源性成分的質量：

其中，m2代表計算得到的鴨源性成分質量(mg)，C1代表提取得到的DNA濃度(ng/μL)，C2代表dPCR中加入的待測樣品DNA濃度(ng/μL)，Y代表鴨肉特異性基因片段拷貝數濃度(拷貝/μL)，k1和b1分別為肉粉質量-DNA濃度之間線性關系式的斜率和截距，k2和b2分別為DNA濃度-鴨肉特異性基因片段拷貝數濃度線性關系式的斜率和截距。

1.3.7 人工模擬樣品的檢測 為驗證所建微滴數字PCR方法的準確性以及在多種肉樣混合時的抗干擾能力，以總質量為50 mg，鴨肉質量分別在45 mg (90%)、25 mg(50%)和5 mg(10%)時與其他單一肉種進行兩兩混合，在30 mg(60%)、10 mg(20%)和5 mg(10%)時與其他多肉樣混合。提取混合肉樣的DNA，將模板進行10倍稀釋后，取4 μL進行微滴數字PCR檢測。

1.3.8 市售樣品的檢測 分別從某市場中購買含有鴨肉的肉制品，用建立的微滴數字PCR定量方法對其肉源性成分的質量進行分析，進一步驗證所建方法的準確性和實際應用能力。

1.3.9 數據分析 所有結果采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，利用EXCEL進行圖表編輯。

2 結果

2.1 引物和探針的特異性 為驗證本試驗選用的鴨源性成分引物和探針的特異性，選擇常見肉(豬肉、羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉)及植物樣品(小麥、玉米、水稻)作為陰性樣品進行數字PCR檢測，結果顯示，以鴨肉陽性對照為模板時拷貝數為4 340 拷貝/μL，當以其他物種的DNA為模板時拷貝數均為0，說明該引物和探針能夠特異性擴增鴨肉的DNA，對其他成分無交叉反應，表明該引物和探針具有良好的特異性。

圖1 鴨源性引物和探針的特異性檢測Fig.1 The specificity detections of duck primer-probe systemduck: 陽性對照的拷貝數； 1～8: 陰性樣品的拷貝數； 9: 水的拷貝數duck: The copy number of the positive control; 1～8: The copy number of the negative sample; 9: The copy number of water

2.2 鴨肉樣品質量與樣品DNA濃度之間線性關系式的確定 分別稱取10個不同質量梯度的鴨肉樣品(鴨肉樣品的質量依次為5、10、15、20、25、30、35、40、45 mg和50 mg)，提取DNA后，運用核酸定量分析儀測定每個鴨肉樣品基因組DNA的濃度。通過3次重復測定，結果如圖2所示，鴨肉樣品DNA濃度隨著鴨肉樣品質量的增加而增加，兩者呈現明顯的線性關系。由此可以表明，鴨肉樣品質量在5～50 mg范圍內時，鴨肉樣品質量與鴨肉樣品DNA濃度有明顯的線性關系，由標準工作曲線可得到鴨肉樣品質量-鴨肉樣品DNA濃度的線性關系式為C1= 17.601m1+3.651 3。

圖2 鴨肉樣品質量與鴨肉樣品DNA濃度的關系圖Fig.2 Linear relationship between meat quantity and nucleic acid content of duck

2.3 鴨肉樣品DNA濃度與基因拷貝數之間線性關系式的確定 將提取得到的鴨肉樣品基因組DNA濃度調整為500 ng/μL，進行適當倍數的梯度稀釋，稀釋成8個不同濃度梯度的DNA樣品(8個DNA樣品的濃度依次為：12.5、25、37.5、50、62.5、75、87.5 ng/μL和100 ng/μL)，然后分別取4 μL DNA樣品為模板，進行微滴數字PCR擴增。結果見圖3，微滴數字PCR反應體系中模板DNA含量在50～400 ng，模板DNA含量與基因拷貝數之間呈明顯的線性關系，由標準工作曲線可得到模板DNA含量與基因拷貝數的線性關系式為Y=11.554C2-38.256。

圖3 鴨肉模板DNA含量與基因拷貝數的關系圖Fig.3 Linear relationship between nucleic acid content and the DNA copy number of duck

2.4 鴨肉樣品質量與基因拷貝數之間關系式的確定 根據2.2和2.3建立關系式，選擇以鴨肉樣品DNA濃度C作為中間換算變量，計算鴨肉樣品質量與基因拷貝數之間的關系，得到鴨肉樣品質量-基因拷貝數的關系式，即為M=(NY+38.256N-42.187V)/203.362V。V指模板DNA的體積，N指基因組DNA稀釋倍數。

2.5 模擬樣品的檢測 為了驗證本試驗建立的定量檢測肉制品中鴨源性成分含量的準確性，分別對已知鴨源性成分含量的模擬混合肉樣進行檢測。結果顯示，每一種模擬混合肉樣中測出的鴨源性成分的含量與真實值基本一致，由此說明，本試驗建立的定量檢測肉制品中鴨源性成分含量的方法準確性高，可以實現對肉及肉制品中鴨源性成分的定量檢測。而且，該方法不受模擬混合肉樣中其他外源肉樣的干擾，因此，表明該方法可以應用于不同肉制品中鴨源成分的定量檢測。

2.6 市售肉制品中鴨源性成分含量的定量測定 市售樣品復雜多樣，含有多種成分，而DNA的提取過程往往會受到多種因素如組織成分、樣品處理方式等的影響，導致測得的肉制品的質量不能反應真實值。因此，為檢測本試驗建立的定量檢測肉制品中鴨源性成分含量方法的市場應用能力，對收集的51份市售牛、羊肉制品進行了檢測。結果如表3所示，在抽檢的51份樣品中，有10份牛、羊肉制品摻有鴨肉，摻有鴨肉的樣品(摻假樣品)所占的比例為19.61%，而且摻假樣品中鴨肉的最大含量達到了89.23%，說明本試驗建立的定量檢測方法具有潛在的市場應用價值。

3 討論

肉和肉制品中的“摻雜使假”是中國食品質量控制面臨的主要挑戰之一[15]。目前肉制品中鴨源性成分的研究也是各科研機構的研究重點[16-18]，所以建立準確性高、操作性強且易于推廣的定量檢測技術是非常必要的。

qPCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸含量[19-21]，是一種相對定量的方法。而數字PCR作為一種新興的、準確的定量技術，可通過對陽性微滴分析，直接數出DNA分子的個數，為肉源成分檢測提供了新的技術[22]。

表2 模擬混合肉樣中鴨源性成分含量的檢測結果Table 2 The results of the samples derived ingredients from mixed meat

表3 市售肉樣品中鴨源性成分的定量結果Table 3 The results of quantification samples from the local supermarket

本試驗建立了定量測定肉制品中鴨源性成分的數字PCR檢測方法，分析了肉樣的質量與拷貝數的關系，發現前期不需要構建質粒標準分子，而是使用基因組DNA直接進行測定，證明了數字PCR技術可以應用于肉及肉制品中種源成分的定量分析。這對于市售樣品中某種肉源成分的無意沾染或有意添加可以進行準確的判斷，增加了檢測效率。

對模擬混合肉樣的檢測發現，無論在兩兩混合還是多肉樣混合的情況，模擬混合肉樣中測出的鴨源性成分的含量與真實值基本一致，體現了數字PCR定量的準確性，同時說明本方法具有較強的抗干擾能力。在市售肉制品的檢測中，不但發現市售肉樣品存在一定的摻假現象，而且對其含量進行了定量，為肉制品日常檢測及是否摻假提供有力的科學依據，是防止商家摻假牟利的有效手段。

微滴發生器理論上可以形成2×104個微滴，但是在實際檢驗中，對于操作者技術有一定的要求，反應體系混勻后轉移至微滴發生板時，反應體系可能有少量未完全加入，或者加入時產生氣泡；微滴生成后，過于激烈的動作會導致微滴破裂，以及微滴分析時儀器會排除不合格的微滴不予以讀數，這些都會使最終的有效微滴少于2×104個。但是軟件是根據泊松分布及陽性微滴的比例計算目標分子濃度的，而不是陽性微滴的絕對個數，因此只要微滴超過1×104個，都可以給出準確的結果。對于含量較低的樣品，因為取樣誤差大，加之其他操作誤差等均會導致檢測結果不穩定，因此建議實際工作中，對于含量低的樣品應該多做幾次平行實驗，以減小實驗誤差。

綜上所述，本試驗所建立的數字PCR檢測體系彌補了傳統檢測方法的缺陷，更加快速、準確、靈敏，且可以進行絕對定量，可滿足當前食品中種源性成分摻假的定量檢測，為質檢部門打擊不法商販的食品摻假、造假行為，維護消費者合法利益提供有力的科學依據。