11株禽腺病毒遺傳變異分析

楊小蓉，王 楠，王天愷，王增福，李曉冉，潘 文，孟凡磊，馬 良

(1.中牧實業股份有限公司，北京 豐臺 100070；2. 農業部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京 海淀 100095；3. 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術研究中心，北京 海淀 100095；4. 乾元浩生物股份有限公司，北京 豐臺 100070)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是無囊膜的雙鏈DNA病毒，直徑70～90 nm，核衣殼呈 20 面對稱結構。禽腺病毒分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個群，是家禽和野禽常見的傳染病病原之一[1-2]。其中，Ⅰ群病毒自然宿主和實驗宿主廣泛，不僅感染雞，也在火雞、鴨、鵝、鴿、鴕鳥等野生禽類中分離到該病毒，引起多種家禽或野禽的臨床和病理癥候群[1-3]。

FAdV外殼由240個六鄰體(Hexon)、12個五鄰體(Penton base)和纖維蛋白部分構成。Hexon蛋白是病毒粒子的主要結構蛋白，由Hexon基因編碼，大小為120 kDa，含有型、群和亞群的特異性抗原決定簇，能引發很強的中和反應[4]。目前已知FAdVⅠ群分為A、B、C、D、E 五個種，根據血清交叉中和反應又分為12 個血清型；A種包括血清1型，B種包括血清5型，C種包括血清4型和血清10型，D種包括血清2、3、9型和11型，E種包括血清6、7、8a 和 8b型[5]。各血清型 FAdV 均可感染雞，引起不同程度的肝炎癥狀；感染FAdV相關的疾病主要有雞包涵體肝炎、肌胃糜爛及心包積水綜合征等[5-6]。雞包涵體肝炎主要發生于3～5周齡雞，以肝臟壞死和肝炎為主要特征，死亡率10%左右。肌胃糜爛以 FAdV 血清1型的雞胚致死孤兒病毒為主要病原，以肌胃糜爛為主要特征，我國尚未有報道。心包積水綜合征主要由血清型4型FAdV感染引起，剖檢以心包積液或心包內膠胨狀物為特征，伴肝臟壞死，病雞表現為突然發病迅速死亡，死亡率達30%～90%。

2019年從32個養雞場采集發病雞只(肉雞、蛋雞)組織共計88份，通過SPF雞胚傳代增殖，經PCR鑒定，其中12個養雞場共計24份為禽腺病毒陽性，場發病率為37.5%(12/32)，病料陽性率為27.27% (24/88)，共分離到11株FAdV 毒株，并在線NCBI Blast進行了Hexon基因比對分析，分別為9株 FAdV C-4、1株FAdV D-3和1株FAdV E-8b。本試驗選擇對11株FAdV 毒株進行基因變異分析，以期為相關研究及后續產品的研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2019年以來自廣西、江蘇、上海、云南、河北等地發病養雞場采集的病料。

1.2 試劑材料 病毒RNA/DNA提取試劑盒、高保真DNA聚合酶等試劑，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 病毒DNA的提取及Hexon基因PCR擴增測序 采用病毒RNA/DNA kit試劑盒進行病毒核酸的提取純化，按照病毒RNA/DNA kit試劑盒說明書操作。根據GenBank發表的FAdV序列設計了FAdVHexon基因擴增引物。PCR反應體系：10×Buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物各1 μL，DNA 2 μL，高保真Taq酶 1 μL。PCR反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34個循環；72 ℃ 8 min。用1%瓊脂凝膠電泳對PCR擴增產物進行觀察，然后對PCR陽性產物進行回收，送至北京鉑尚公司進行測序。

1.4 序列拼接與分析 應用DNASTAR、ClustalX、GeneDoc等生物學軟件進行FAdV基因的拼接，與GenBank收錄的國內外參考毒株進行比對與分析。用于本試驗分析的毒株見表1。

表1 試驗中所用的FAdV參考毒株及來源Table 1 Origin of FAdV isolates used in this test

2 結果

2.1 FAdVHexon基因核苷酸序列及其推導編碼的氨基酸序列同源性分析 通過應用軟件分析發現，本試驗獲得的11個FAdVHexon高變區基因序列相互之間核苷酸相似性為66.1%～100.0%，其推導的氨基酸相似性為56.5%～100.0%，見表2。其中，GX-1907021、GX-1908029、GX-1909030、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909031和YN-1909033共9株序列基因長度均為738 nt，編碼246個氨基酸；GX-1901001毒株序列基因長度均為750 nt，編碼250個氨基酸；HB-1911039毒株序列基因長度均為756 nt，編碼252個氨基酸。

表2 FAdV Hexon基因核苷酸及推導編碼的氨基酸序列與國內外參考毒株同源性比較Table 2 Comparison of nucleotide sequences and deduced amino acid homology of Hexon gene of FAdV with reference strains

2.2 依據FAdVHexon基因推導編碼的氨基酸序列繪制遺傳進化樹 利用MegAlign 軟件對所獲得的11個FAdVHexon基因和國內外具有代表性的13個毒株序列進行多序列比較，構建系統進化樹(見圖1)。

圖1 依據Hexon基因高變區推導的氨基酸繪制進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on deduced amino acid sequence of the Hexon genes

與國內外參考毒株相比，本試驗擴增得到的11個高變區基因序列屬于C群、D群和E群。從進化樹圖譜中顯示，GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031同屬于以Fowl adenovirus C為代表的C群；GX-1901001屬于以Fowl adenovirus D為代表的D群；HB-1911039屬于以FAdV-HNQX-101017-B為代表的E群。本試驗獲得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的變異或缺失。

9株腺病毒的Hexon基因高變區與C群代表株SDJN0105親緣性更近，其核苷酸序列和推導編碼的氨基酸與SDJN0105相似性分別為99.9%～100.0%和99.6%～100.0%；1株腺病毒的Hexon基因高變區與D群代表株Fowl adenovirus D親緣性更近，其核苷酸序列和推導編碼的氨基酸與Fowl adenovirus D相似性分別為94.7%和92.8%；1株腺病毒的Hexon基因高變區與E群代表株FAdV-HNQX-101017-B親緣性更近，其核苷酸序列和推導編碼的氨基酸與FAdV-HNQX-101017-B相似性為99.1%和99.2%。

2.3Hexon基因核苷酸序列及其推導編碼的氨基酸序列的變異分析 本試驗得到的GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031共9株腺病毒的Hexon基因高變區與親緣性更近的C群代表毒株SDJN0105進行序列比對，GX-1909030株核苷酸序列在629位堿基存在A→C突變，其推導編碼的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突變。

GX-1901001株與親緣性更近的D群代表毒株Fowl adenovirus D進行序列比對，存在堿基的點突變(見圖2)，其中在230～232位存在3個堿基(AGT)的缺失；GX-1901001株推導編碼的氨基酸序列氨基酸缺失和突變(見表3)；HB-1911039株與親緣性更近的E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B進行序列比對，存在堿基的點突變(見表4)，其推導編碼的氨基酸序列在123位和127位分別存在A→G和V→M突變。

圖2 GX-1901001株FAdV Hexon基因高變區與D群代表株比對分析Fig.2 Alignment of nucleotide sequences of Hexon gene region of FAdV GX-1901001 with Fowl adenovirus D·：保守的堿基;-：缺失的氨基酸·：Conserved amino acid;-：Deleted amino acid

表3 GX-1901001株Hexon基因推導編碼的氨基酸的變異Table 3 Amino acid variation of Hexon gene of FAdV of GX-1901001

表4 HB-1911039株Hexon基因核苷酸序列的變異Table 4 Nucleotide sequences variation of Hexon gene of FAdV of HB-1911039

3 討論

Hexon蛋白是FAdV的主要免疫保護性蛋白，含主要的特異性抗原決定簇和被中和抗體識別的表位，能誘導特異性的抗體產生，是FAdV分型的重要依據。

基于Hexon基因高變區核苷酸序列分析，2019年國內發生的FAdV可分為C-4、D-3和E-8b共3個型。其中，C-4型GX-1909030株與C群代表毒株SDJN0105進行序列比對，核苷酸序列在629位堿基存在A→C突變，其推導編碼的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突變。D-3型GX-1901001株與D群代表毒株Fowl adenovirus D進行序列比對，分別有39個核苷酸存在點突變，而230～232位存在3個堿基(AGT)的缺失；其推導編碼的氨基酸序列有18個位點存在氨基酸突變，而在77位存在氨基酸(E)缺失。E-8b型HB-1911039株與E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B進行序列比對，在30、66、168、368、379、444、546位堿基分別存在C→T、C→G、A→C、C→G、G→A、C→G、A→C點突變，其推導編碼的氨基酸序列在123位和127位分別存在A→G和V→M氨基酸突變。目前，關于 FAdV-3型禽腺病毒的相關試驗相對較少，該病毒的致病特性、適應性、所引起的臨床癥狀等報道較少；而在本試驗采集的雞場發病情況顯示，該毒株致病性較強，引起雞群死亡率顯著增加，剖檢發現肝臟發黑壞死；說明FAdV-3型GX-1901001株變異和缺失可能是導致其致病性升高的原因[6-7]。

本試驗獲得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的變異或缺失，在進化樹中已形成多個小分支。由此說明目前國內養雞場發生的FAdV在流行過程中變異較大，可能影響現有疫苗保護效力[8]。

因此，監測和分析我國FAdV的Hexon基因變異情況，為FAdV變異演化提供了有價值的基因信息數據，對于疫苗開發及制定防控策略均有重要指導意義。