快速溶劑萃取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速測(cè)定淀粉類農(nóng)作物中4種形態(tài)硒

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(1.浙江省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,杭州 310012; 2.浙江環(huán)境監(jiān)測(cè)工程有限公司,杭州 310012;3.賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,上海 201206)

硒具有抗癌、保護(hù)肝臟、消除自由基和提高免疫等生物學(xué)功能[1]。自然界中硒主要以無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形態(tài)存在。無機(jī)硒主要是硒酸根[Se(Ⅵ)]和亞硒酸根[Se(Ⅳ)],有機(jī)硒主要指硒代氨基酸和含硒蛋白質(zhì)。硒代氨基酸在生物體內(nèi)最主要的形態(tài)是硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基-硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(Se Met)[2]。不同形態(tài)的硒化合物營(yíng)養(yǎng)學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)不同。無機(jī)硒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高,且過量有毒。對(duì)人體有益的其實(shí)是有機(jī)硒(主要是Se Met)[3]。因此檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中硒含量時(shí)不僅要測(cè)元素總量,還要測(cè)其形態(tài)。但形態(tài)硒尤其是有機(jī)硒很不穩(wěn)定性,在提取和保存過程中易發(fā)生變化,這是形態(tài)硒檢測(cè)的難點(diǎn)。

稻米、玉米、番薯等農(nóng)作物是中國(guó)糧食作物的主要品種,其含有較高的淀粉比例。這類農(nóng)作物中的形態(tài)硒主要以非水溶性為主,采用普通的酸、緩沖鹽無法完全提取。為準(zhǔn)確測(cè)定其形態(tài)硒含量,在前處理時(shí)一般需加入蛋白酶進(jìn)行酶解提取。目前常用的提取方法有水浴振蕩或超聲波法。前者萃取效果好、但耗時(shí)很長(zhǎng),需5～36 h不等[4-5];后者提取速率快,但工作時(shí)產(chǎn)生的熱量會(huì)使對(duì)溫度敏感的蛋白酶失去生物活性,進(jìn)而影響酶解效果。還有報(bào)道超聲波會(huì)破壞硒化合物的結(jié)構(gòu)[2,5]。快速溶劑萃取(ASE)是近十年來新興的快速提取技術(shù)[6]。本工作采用快速溶劑萃取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ASE-HPLC-ICP-MS)測(cè)定淀粉類農(nóng)作物中常見的5種形態(tài)硒[Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、MeSeCys、Se Met]的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

賽默飛世爾iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;戴安ICS-1500型高效液相色譜;戴安ASE 350型加速溶劑萃取儀。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):Se(Ⅵ)(GBW 10033)、Se(Ⅳ)(GBW 10032)、MeSeCys(GBW 10088)、SeCys2(GBW 10087)。

SeMet純度為98%;富硒小麥粉國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-BC210a);七氟丁酸和甲醇均為色譜純;磷酸二氫鉀為優(yōu)級(jí)純;蛋白酶XIV(酶活性不小于3.5 U·mg-1);蛋白酶K(30 U·mg-1);試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)快速溶劑萃取條件 工作溫度40 ℃;壓力10 MPa;加熱時(shí)間5 min,靜態(tài)萃取時(shí)間5 min;循環(huán)次數(shù)3次;氮?dú)獯祾邥r(shí)間100 s;浸提試劑為純水,沖洗體積100%。

2)色譜條件 Hypersil Gold C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為20 mmol·L-1磷酸二氫鉀-0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)七氟丁酸-5%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇混合溶液,等度分離;流量為1.2 mL·min-1。

3)ICP-MS條件 射頻功率為1 550 W;霧化氣流量為0.90 L·min-1,冷卻氣流量為14.0 L·min-1,輔助氣流量為0.8 L·min-1,碰撞氣流量為4.5 mL·min-1;保留時(shí)間為0.1 ms;檢測(cè)同位素為78Se。

1.3 試驗(yàn)方法

將去皮的土豆切成小塊,玉米用水沖洗3次后,放入冷凍機(jī)中干燥,再用粉碎儀磨成粉狀;稻米和蓮子直接磨成粉狀保存。分別稱取0.300 0 g樣品和0.03 g蛋白酶XIV于樣品池中,混勻,用水作提取劑。提取后,用水定容至100.0 mL,搖勻,立即用超濾離心管過濾后供HPLC-ICP-MS測(cè)定。提取液于4 ℃保存,24 h內(nèi)完成上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

不同代表性樣品的色譜圖見圖1。

2.2 酶解試劑及其加入量的選擇

蛋白酶XIV[7]和蛋白酶K[8-9]是常用的酶解試劑。以0.300 0 g含有SeMet的小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-BC210a)為試驗(yàn)對(duì)象,試驗(yàn)考察了這2種酶及其不同加入量(0～0.06 g)對(duì)SeMet提取效果的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知:蛋白酶XIV的酶解效果明顯優(yōu)于蛋白酶K。蛋白酶XIV的加入量增加到0.03 g時(shí)SeMet的萃取濃度達(dá)到了峰值。因此,試驗(yàn)選擇蛋白酶XIV作為樣品的酶解試劑,其加入量為0.03 g。

2.3 ASE工作參數(shù)的選擇

圖1 不同樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the different samples

圖2 蛋白酶加入量試驗(yàn)Fig.2 Test of the added amount for protease

蛋白酶XIV的最佳酶解溫度約為37 ℃。由于ASE儀器最低加熱溫度為40 ℃,試驗(yàn)考察了室溫、40 ℃和43℃等3個(gè)溫度下蛋白酶XIV對(duì)含Se Met小麥粉的酶解效果的影響。結(jié)果表明:當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí),提取效率最高,提取效率達(dá)到了90%以上;當(dāng)酶解溫度大于40℃時(shí),蛋白酶逐漸失活,提取效率降低。

試驗(yàn)同時(shí)考察了5,10,15 min不同的靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明:3個(gè)不同靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)萃取效率作用沒有顯著區(qū)別,則試驗(yàn)選擇最小值5 min。為了確保充分的提取,采用循環(huán)提取3次,每個(gè)樣品完成提取總計(jì)需要時(shí)間為25 min,提取速率明顯優(yōu)于水浴振蕩法。

2.4 提取過程形態(tài)硒的穩(wěn)定性試驗(yàn)

50μg·L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液放置60 d,回收率仍可達(dá)到90%以上。為了檢查ASE提取過程是否破壞形態(tài)硒的結(jié)構(gòu),對(duì)Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、SeCys2和Se Met等5種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液及小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取液的穩(wěn)定性進(jìn)行了試驗(yàn),結(jié)果見表1。

表1 形態(tài)硒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of stability test of the selenium species

由表1可知:20μg·L-1硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液提取液放置1 d后檢測(cè),除SeCys2的回收率降為11.2%,其余4種形態(tài)硒回收率良好。SeCys2結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定性,其Se-Se鍵極易斷裂分解[2]。酶解試劑的生物活性可能加速了其Se-Se鍵的斷裂,導(dǎo)致了SeCys2的快速分解。而加標(biāo)小麥粉提取液未經(jīng)超濾離心放置1 d后檢測(cè),除Se(Ⅵ)外,其余4種形態(tài)硒的回收率均很低,尤其是Se(Ⅳ)和Se Met的回收率均為零。文獻(xiàn)[8]對(duì)巴西堅(jiān)果的蛋白酶K提取液進(jìn)行Se(Ⅳ)加標(biāo)試驗(yàn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)其回收率為零,推斷是酶提取液中的生物大分子將Se(Ⅳ)還原為硒離子(Se2-)或硒元素。而SeCys2、MeSeCys和Se Met的回收率低可能是殘留的蛋白酶XIV與其發(fā)生了進(jìn)一步的反應(yīng)。提取完成后立即用超濾離心管過濾去除生物基體和蛋白酶后檢測(cè),除SeCys2的回收率為10.2%外,其余4種形態(tài)硒的回收率為8.0%～109%,結(jié)果令人滿意。經(jīng)過濾后的提取液放置3 d后復(fù)測(cè),其回收率為1.8%～77.1%。因此,樣品提取液應(yīng)于4 ℃低溫保存,24 h內(nèi)盡快完成上機(jī)分析。

2.5 色譜分離條件的選擇

反相離子對(duì)色譜結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法常被用于形態(tài)硒的分離檢測(cè)。全氟羧酸[10]、烷基磺酸鈉、氫氧化四甲基銨等反相離子對(duì)試劑[11]可作為流動(dòng)相成分。目前HPLC-ICP-MS測(cè)定形態(tài)硒的報(bào)道中最常采用的液相柱為Hamilton PRP陰離子交換柱[7],采用Waters Symmetry Shield RP18[12]和C18柱[3]等,C8柱的報(bào)道極為少見。試驗(yàn)以Hypersil Gold C8柱為分離柱,以0.1%七氟丁酸溶液為反相離子對(duì)試劑,通過加入不同濃度的鹽來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸度和離子強(qiáng)度以優(yōu)化分離效果。結(jié)果表明:加入10～30 mmol·L-1氯化銨溶液時(shí),流動(dòng)相為中性,C8柱無法分離Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ);加入10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液時(shí),流動(dòng)相呈酸性,兩種無機(jī)硒得到了有效分離。這可能是兩者在酸性條件pKa值不同導(dǎo)致[13]。但該條件下MeSeCys、Se Met分離效果不佳。磷酸二氫鉀濃度為20 mmol·L-1時(shí)5種形態(tài)硒能夠達(dá)到良好的分離。當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為25 mmol·L-1時(shí)色譜分離時(shí)間進(jìn)一步縮短。考慮到流動(dòng)相要進(jìn)入ICP-MS進(jìn)行定量檢測(cè),高濃度鹽分易堆積在ICP錐孔上引起檢測(cè)信號(hào)漂移,因此,試驗(yàn)選擇磷酸二氫鉀的濃度為20 mmol·L-1。同時(shí)流動(dòng)相還加入了體積分?jǐn)?shù)為5%甲醇溶液以提高流動(dòng)相的極性,可在6 min內(nèi)在C8柱上實(shí)現(xiàn)5種形態(tài)硒的有效分離。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法對(duì)5種形態(tài)硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:5種形態(tài)硒的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈線性關(guān)系,其線性參數(shù)見表2。

按照試驗(yàn)方法對(duì)低濃度植物樣品加入0.5μg·L-1的5種形態(tài)硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn),平行測(cè)定7次,按照HJ 168-2010《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》中的方法,以3.14倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)計(jì)算檢出限。當(dāng)稱樣量為0.3 g,萃取液的定容體積為100 mL時(shí),方法的檢出限(3.14s)結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法在蓮子樣品中同時(shí)加入低和高2個(gè)濃度水平的5種形態(tài)硒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測(cè)定,6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表3。

由表3可知:Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met回收率為81.6%～110%,SeCys2不穩(wěn)定性,在酶解過程極易分解,回收率極低。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)ERM-BC210a國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)富硒小麥粉進(jìn)行測(cè)定,經(jīng)含水率(95%)折算后,測(cè)得Se Met的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.72 mg·kg-1,與認(rèn)定值為(10.8±1.0)mg·kg-1相符。試驗(yàn)采集、檢測(cè)了浙江省各個(gè)地市約20個(gè)土豆、玉米、稻米、蓮子等淀粉類農(nóng)作物,結(jié)果以Se(Ⅳ)為主,僅2個(gè)樣品中檢出Se(Ⅵ),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.30 mg·kg-1,均未檢出有機(jī)硒。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

本工作以ASE為前處理方法、C8柱為分離柱,建立了一種淀粉類農(nóng)作物中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met的HPLC-ICP-MS快速分析方法。單個(gè)樣品的前處理時(shí)間短,優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1903.28-2018中的36 h。本方法操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、適合在農(nóng)業(yè)部門推廣使用。SeCys2在C8柱上也可以有效分離,但由于在酶解提取過程易裂解而無法準(zhǔn)確測(cè)定,這將是課題組后續(xù)工作繼續(xù)研究的方向。