肉桂精油成分分析及其抗氧化性和抑菌活性的研究

李 娜 喬宏萍 劉 地 李 博 武曉英 李曉君

(太原師范學院1，晉中 030619) (中北大學2，太原 030003)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)，又稱大桂、牡桂、菌桂和中國桂等，屬雙子葉樟科喬木[1]。桂皮是肉桂干燥的樹皮，常被用于傳統中藥、食品香料以及烹飪調料等[2，3]。肉桂精油廣泛存在于肉桂的花、葉、果實和樹皮等器官中[4]。肉桂精油是一種具有揮發屬性的油，顏色可從黃色到紅棕色[5]。肉桂精油不僅能擴張末稍血管、促進血液循環流動，還有助于強化消化道的排氣功能，避免體內的腸胃發生痙攣，同時也有助于強化腸胃的消化功能[6]。另外，肉桂精油還具有促進胰腺分泌胰島素的功能，并且可以清除血液中已經受損的膽固醇，不但可以在某種程度上降低血糖和血脂在人體內的含量[7，8]，而且其本身所具有食療效果還可以在一定程度上預防癌癥的發生[9]。

肉桂精油的組成成分有很多，其中主要包含了萜類、芳香族小分子化合物、脂肪族小分子化合物、木脂素類以及多糖類等[10-12]。佘世望等[13]通過對包括肉桂在內的60多種植物的抗氧化性比較分析，說明這60多種植物的抗氧化活性強弱的數據。Wang等[14]利用濾紙片法和二倍稀釋法測定肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌的抑菌活性，結果表明肉桂精油對兩種菌均有抑制作用，但對腐生葡萄球菌的抑菌能力明顯優于成團泛菌。郭新春等[15]通過對20種不同的植物材料的比較和研究，結果表明這20種植物中肉桂和牡丹皮的抑菌活性比較好，抑菌效果最為明顯。顧仁勇等[16]通過肉桂的抑菌試驗研究，證明了肉桂精油不僅可以抑制細菌，還可以真菌和酵母菌，而且抑菌活性較強。因此，通過對肉桂精油的深入研究，為其在新型食品防腐劑、香科、抑菌劑和殺蟲劑等[17]產業的開發利用提供了科學依據。

目前，全世界都在密切關注食品的安全問題，由于許多天然植物資源具有無毒、抗氧化性強的等優點[18]，不斷擴大的食品添加劑及香料市場也逐步將注意力從傳統的化學合成產品轉移到天然植物產品上，而植物精油作為一種天然無毒的植物次生代謝產物而應用到食品添加劑領域將成為可能。因此，對天然植物精油在抗氧化和抑菌等方面的研究成為了熱點。本課題以肉桂精油為研究對象，通過GC-MS定性及定量研究其組成成分，并對其體外抗氧化性及抑菌活性進行測定，為開發應用新型抗氧化劑和抗菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肉桂；正己烷：色譜純；DPPH、ABTS：分析純。

供試菌株：大腸桿菌(EscherichiacoilCGMCC 44568)、金黃色葡萄球菌(StaphylococusaureusCGMCC 26085)均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心

Trace 1300/ISQ氣相色譜-質譜聯用儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取肉桂精油

將肉桂干燥粉碎，將過80目篩的肉桂粉末置于燒瓶中，按料液比1∶10加入蒸餾水進行提取，精油提取的時間為5 h，提取溫度100 ℃。收集精油，測定肉桂精油的提取率。

1.2.2 精油提取率測定

以一定質量肉桂粉碎物提取所得精油的質量來衡量精油提取率。按公式(1)計算：

(1)

1.2.3 肉桂精油組成成分GC-MS檢測

采用Trace 1300系列氣相色譜與ISQ單四極桿質譜檢測器(thermo fisher scientific USA)相連，與氣相色譜連接的柱子為TR-5MS毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)。檢測升溫程序為：在55 ℃的溫度下持續3 min，以3 ℃/min的速率將溫度從55 ℃升至250 ℃，然后在這個溫度下保持5 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃；載氣調整為流速是1 mL/min的氦氣。精油在處理后用色譜純正己烷稀釋，進樣量1 μL，分流比5∶1。測定精油成分所需的質譜條件為：電子轟擊源，其電離能量70 eV，電子電離質譜范圍33～550m/z。

1.2.4 肉桂精油抗氧化性測定[19]

1.2.4.1 DPPH·清除能力測定

將肉桂精油稀釋至不同濃度，每個濃度的肉桂精油樣品取0.3 mL加入試管中，于每個試管中分別加入體積為2.7 mL 濃度為60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，在室溫條件下避光反應30 min，于518 nm處測定溶液的吸光度值。以含有0.3 mL的去離子水和2.7 mL 的DPPH溶液作為A0測定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的DPPH溶液作為As測定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的無水甲醇溶液作為Ar測定其吸光度值，用無水甲醇溶液作為測定吸光度值過程中的空白對照，用BHT作為實驗測定過程中的陽性對照。根據式(2)計算肉桂精油對DPPH·的清除率。

(2)

式中：I為肉桂精油對DPPH·的清除率/%；A0為DPPH溶液加去離子水作為空白對照的吸光度值；As為肉桂精油樣品溶液與DPPH溶液進行反應后的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS·清除能力測定

分別配制濃度為7 mmol/L的 ABTS溶液和濃度為2.5 mmol/L的過硫酸鉀溶液，將二者等體積混合，在室溫的條件下避光反應12～16 h，獲得ABTS工作液。測定前用80%的乙醇溶液將ABTS工作液進行稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度值維持在0.7±0.02。將肉桂精油樣品稀釋為不同的濃度，每個濃度的精油樣品取0.3 mL加入試管中，分別加入2.7 mL ABTS工作液于輕輕振蕩使其均勻地混合，室溫避光進行反應30 min，于734 nm處測定溶液的吸光度值，以含有0.3 mL的去離子水和2.7 mL 的ABTS工作液作為為A0測定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL的ABTS工作液作為As測定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的無水乙醇溶液作為Ar測定其吸光度值，用無水乙醇溶液作為空白對照，以BHT為陽性對照。根據式(3)計算肉桂精油對ABTS·的清除率。

(3)

式中：I為肉桂精油對ABTS·的清除率/%；A0為ABTS溶液加去離子水作為空白對照的吸光度值；As為樣品溶液與ABTS溶液進行反應后的吸光度值。

1.2.5 肉桂精油抑菌活性測定

1.2.5.1 抑菌圈測定

采用濾紙片法測定肉桂精油抑菌圈直徑[20]。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在LB培養基上進行菌種的活化培養，然后用無菌的生理鹽水稀釋配成菌懸液，使溶液的含菌數大約為106cfu/mL，搖勻。在無菌環境下，量取100 μL不同供試菌種稀釋后的菌懸液均勻涂布在LB固體培養基上，制成含菌平板。在每個含菌平板中等距放置3個已滅菌的直徑為6 mm的圓濾紙片，1個滴加5 μL的陽性對照液，另2個滴加各5 μL的肉桂精油，37 ℃倒置培養 24 h后測定肉桂精油對兩種細菌的抑菌圈的直徑大小。

注：圖中峰上標的阿拉伯數字表示GC-MS所檢測到的化合物峰編號。圖1 肉桂精油總離子流圖

1.2.5.2 MIC和MBC測定

用微量稀釋法測定精油的MIC和MBC值[21]。將供試菌菌懸液與精油溶液置于96孔板孔內，使其精油濃度為0.125～8 mg/mL，并置于37 ℃培養24 h。以含有氨芐西林為對照組。所有實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 肉桂精油的提取率

經過多次反復提取，肉桂精油的提取率為1.34%，比文獻報道的桂皮精油提取率低[22-24]。可能是由于肉桂精油高溫耐受性較差，因此受提取時間的影響，提取時間過短，會導致肉桂精油的提取不完全；提取時間過長，肉桂精油在高溫下長時間受熱，自身會被氧化，造成有效成分的損失，導致提取率降低。

表1 肉桂精油的提取率

2.2 肉桂精油氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析

采用GC-FID和GC-MS (圖1)對不同肉桂品種的水蒸餾精油的化學成分進行檢測，結果如表2所示。由表可知，GC-MS共鑒定出38種肉桂精油化合物，占肉桂精油總質量的 99.59%，其中相對含量較多的組分為反式-肉桂醛(59.54%)，γ-松油烯(12.90%)，葎草烯(6.58%)，石竹烯(4.22%)，β-紅沒藥烯(2.20%)，視黃醇乙酸酯(1.70%)。肉桂精油不僅包括醛類化合物，烯烴和酯，還包括了醇類和酮類等化合物，其中醛類含量為主要成分，約占總質量的60.12%，烯烴類化合物的質量分數為32.78%，醇類化合物的為2.69%，酯類化合物的為2.61%，酮類化合物的為1.39%。本研究結果與Li等[3]，Chairunnisa等[11], Deng等[4]的研究結果一致，所鑒定的肉桂精油主要成分都是反式肉桂醛，與Aneta等[25]測定的肉桂精油主要成分是芳樟醇Linalool的研究結果不同，導致肉桂精油化學組成不同的主要原因可能是肉桂基因型的不同，同時，土壤、氣候等其他因素也可能是肉桂精油組成成分不同的原因。

表2 肉桂精油主要成分

2.3 肉桂精油的抗氧化性分析

2.3.1 肉桂精油對DPPH·的清除能力

肉桂精油和BHT對DPPH·的清除率如圖2所示。由圖2可知，在實驗濃度范圍內，肉桂精油對DPPH·具有清除能力，當質量濃度低于250 μg/mL時，肉桂精油對DPPH·的清除率隨精油濃度的增大而增大，當質量濃度高于250 μg/mL時，肉桂精油對DPPH·的清除率隨著濃度的增大逐漸趨于穩定，肉桂精油對DPPH·的清除能力的IC50值是96.918 9μg/mL，其最大的清除率可達76.51%；在實驗濃度范圍內，BHT對DPPH·具有清除能力，且其清除率隨著BHT濃度的增大而先提高后逐漸趨于不變，BHT對DPPH·的清除能力的IC50值為4.095 5 μg/mL，其最大清除率高達95.89%。通過對比肉桂精油和BHT這兩種不同抗氧化劑對DPPH·的清除作用可知，天然肉桂精油對DPPH·的清除效果明顯弱于化學合成的抗氧化劑BHT。

圖2 肉桂精油和BHT對DPPH·的清除能力

2.3.2 肉桂精油對ABTS·的清除能力

肉桂精油和BHT對ABTS·的清除率如圖3所示。由圖3可知，在實驗濃度范圍內，肉桂精油樣品對ABTS·具有清除能力，且肉桂精油對ABTS·的清除率與精油樣品的濃度之間存在量效關系。當精油質量濃度低于30 μg/mL時，肉桂精油對ABTS·的清除率隨著肉桂精油樣品濃度的升高而顯著增大，而在質量濃度高于30 μg/mL時，肉桂精油樣品對ABTS·的清除率隨著肉桂精油樣品濃度的提高逐漸趨于穩定，肉桂精油對ABTS·的清除能力的IC50值是6.366 9 μg/mL，其最大清除率可達99.8%；在實驗濃度范圍內，BHT對ABTS·具有較強清除能力，BHT對ABTS·的清除能力的IC50值是1.359 6 μg/mL，其最大清除率可達96.23%。對比肉桂精油樣品與BHT的清除能力可知，肉桂精油樣品對ABTS·的清除效果弱于BHT。

圖3 肉桂精油和BHT對ABTS·的清除

2.4 肉桂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性

肉桂精油對大腸桿菌(a)與金黃色葡萄球菌(b)的抑菌效果如圖4所示。肉桂精油對不同供試菌表現出不同的細菌敏感性。肉桂精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，分別形成了直徑為16、19 mm的抑菌圈，本結果與Cui等[26]的研究結果一致，都證明肉桂精油對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌在短期內都有抑制作用。因此，肉桂精油對這兩種細菌都有比較強抑制性，可被用在食品防腐保鮮領域。

圖4 肉桂精油對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的抑菌圈

表3和表4顯示了在體外培養條件下獲得的肉桂精油的最小抑菌濃度值。結果表明，肉桂油抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的最低劑量(MIC)分別為0.50、0.25 mg/mL，化學合成氨芐西林對兩種菌的MIC值僅為0.031 25 mg/mL 。MIC值越低，抗菌活性越強。肉桂油對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用要比大腸桿菌強，這表明肉桂油對革蘭氏陽性菌的抑制活性高于革蘭氏陰性菌。

表3 牛至精油對大腸桿菌的MIC值/mg/mL

表4 牛至精油對金黃色葡萄球菌的MIC值/mg/mL

3 結論

本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取肉桂精油，提取率為1.34%，實驗過程無任何化學試劑，無污染，節能環保。GC-MS共鑒定分析出38種肉桂精油組成成分，占肉桂精油總質量的99.59%，包括烴烯、酯、醇、醛和酮等多種化合物，其中醛類化合物含量為主要成分，質量分數為60.12%，烯烴類的化合物的質量分數為32.78%，醇類的化合物的為2.69%，酯類化合物的為2.61%，酮類化合物的為1.39%。肉桂精油中相對含量較多的為反式-肉桂醛(59.54%)γ-松油烯(12.90%)，葎草烯(6.58%)、石竹烯(4.22%)。肉桂精油對DPPH·和ABTS·均有清除作用，且清除能力的強弱與肉桂精油濃度之間存在量效關系，肉桂精油對ABTS·清除的能力強于對DPPH·清除的能力，其IC50值分別為96.918 9、6.366 9 μg/mL。肉桂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，其抑菌圈直徑分別為16、19 mm，屬高度敏感。