高效液相色譜法測定小麥粉及其制品中的間苯二酚

別 梅 宿書芳 武傳香 劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 濟(jì)南 250000)

間苯二酚(Resorcinol)是一種重要的化工原料，也是實(shí)驗(yàn)室中一種常用試劑[1]，已被證實(shí)為內(nèi)分泌干擾物，長期接觸可導(dǎo)致皮炎、黏膜炎、驚厥和發(fā)紺等[2]問題。因此，在醫(yī)藥和化妝品產(chǎn)品中有著嚴(yán)格的使用限量[3]。在食品領(lǐng)域，GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將其列為允許使用的食品用合成香料，在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用。但依據(jù)原食藥總局關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告(2017年第132號)，小麥粉中禁止添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚等非食品原料。因此，加強(qiáng)小麥粉中間苯二酚的使用監(jiān)管尤為重要。目前，小麥粉及其制品中間苯二酚的檢測鮮見方法標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道，不僅導(dǎo)致小麥粉及其制品生產(chǎn)企業(yè)在原料進(jìn)貨查驗(yàn)、出廠檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)缺少高效、可靠的檢驗(yàn)方法，還影響食品藥品監(jiān)管部門對小麥粉及其制品生產(chǎn)企業(yè)的日常監(jiān)督檢查與風(fēng)險監(jiān)測。綜上，研究建立小麥粉及其制品中間苯二酚的檢測方法意義重大。

已報道的測定間苯二酚的方法有分光光度法[5]、電化學(xué)法[6]、同步熒光法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9]、離子色譜法[10]和液相色譜法[11-15]等，其中液相色譜法最為普遍和可靠，檢測器多為紫外或熒光檢測器，在小麥粉中的檢測報道不多，而小麥粉制品中的使用鮮見報道，本研究將GB 2760—2014中小麥粉及小麥粉制品分類下的各個子類作為研究對象，建立一種通用的測定間苯二酚含量的高效液相色譜方法，采用二極管陣列檢測器和熒光檢測器串聯(lián)檢測，有效避免了單一檢測器定性手段單一的問題，較為有效地減少假陽性的存在，增強(qiáng)定性定量可靠性，方法操作簡單、靈敏度高、選擇性好、檢出限低，適用于小麥粉及其制品中痕量間苯二酚的定性、定量檢測，能滿足監(jiān)管需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇：色譜純、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：優(yōu)級純、有機(jī)相微孔濾膜：0.22 μm。實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682—2016規(guī)定的一級水要求。

小麥粉、饅頭、油條、面條、炸雞粉：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器和熒光檢測器，超聲清洗儀，離心機(jī)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，工作溶液用甲醇逐級稀釋。

1.4 樣品前處理

稱取5 g樣品于25 mL比色管中，加入15 mL甲醇渦旋混勻，超聲15 min, 加入1 mL亞鐵氰化鉀(0.25 mol/L)和1 mL乙酸鋅(1 mol/L),用甲醇定容至刻度，搖勻。于7 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18-Amide (3.5 μm,150 mm×4.6 mm)；流動相：A為水，B為甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；二極管陣列檢測器(PDA)串聯(lián)熒光檢測器，PDA檢測器檢測波長273 nm，熒光檢測器激發(fā)波長273 nm，發(fā)射波長304 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱及流動相的選擇

文獻(xiàn)報道中，間苯二酚的分離測定多使用C18柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間苯二酚在常規(guī)C18柱上出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致分離度降低、靈敏度減弱，精密度變差，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過比較發(fā)現(xiàn)，C18-Amide柱能有效解決間苯二酚的拖尾問題。比較了C18柱和C18-Amide柱的峰形(圖1)，在測試液濃度為10 μg/mL時，C18柱色譜峰拖尾因子為1.768，而C18-Amide的拖尾因子為1.082，拖尾因子明顯降低，峰形對稱良好。這是因?yàn)镃18-Amide柱是一種復(fù)合作用模式的色譜柱，在C18疏水作用的基礎(chǔ)上，鍵合的酰胺基可以增加極性化合物的保留并提供替代選擇性，從而改善了含酚羥基等極性基團(tuán)的化合物的保留。實(shí)驗(yàn)最終選擇C18-Amide為間苯二酚的分離色譜柱。實(shí)驗(yàn)還考察了不同流動相條件對間苯二酚的保留行為的影響。分別以甲醇/水、乙腈/水、甲醇/醋酸銨(20 mmol/L)、乙腈/醋酸銨(20 mmol/L)為流動相，考察間苯二酚的保留及分離情況。結(jié)果表明，幾種流動相條件下峰形和保留均無明顯差別。從經(jīng)濟(jì)角度及操作實(shí)用性等方面考慮，選擇甲醇/水作為流動相。

圖1 不同色譜柱的峰形比較

2.1.2 檢測波長的選擇

采用PDA檢測器，提取間苯二酚的光譜圖(圖2)，由圖2可以看出，目標(biāo)物在196.7 nm和273.4 nm處有最大吸收和特征吸收。由于196.7 nm波長較短，干擾較多，故選擇273 nm為PDA檢測器的檢測波長以及熒光檢測器的激發(fā)波長。固定激發(fā)波長，對發(fā)射波長進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在304.7 nm處熒光響應(yīng)最強(qiáng)(圖3)。因此確定熒光檢測器激發(fā)波長λex為273 nm, 發(fā)射波長λem為304 nm。

圖2 間苯二酚在190-750 nm波長范圍內(nèi)的光譜圖

圖3 激發(fā)波長273 nm時的發(fā)射波長掃描圖

2.1.3 前處理條件的優(yōu)化

間苯二酚易溶于水、甲醇、乙醚等溶劑。小麥粉及其制品多為高淀粉基質(zhì)，若直接以水為提取劑，樣品的分散性較差，回收率較低。實(shí)驗(yàn)分別以不同比例的甲醇/水為提取劑，比較不同提取劑的提取回收率，間苯二酚的回收率隨甲醇濃度增高而增高，當(dāng)甲醇比例到達(dá)80%后，回收率趨于穩(wěn)定。由于饅頭、面條等小麥粉制品吸水性較強(qiáng)，從精準(zhǔn)定量的角度，選擇純甲醇為最優(yōu)的樣品提取劑。

實(shí)驗(yàn)考察了前處理沉淀劑對目標(biāo)物回收率及凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加與不加亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀劑對回收率及色譜峰均無明顯差異。但是不經(jīng)沉淀處理的樣品溶液，在冷藏或長時間放置后會析出沉淀物，不利于批量樣品的同時測定。而經(jīng)沉淀處理的樣品溶液不因放置時間的長短而出現(xiàn)沉淀物。因此，批量測定時，在不能保證立即進(jìn)行儀器分析的情況下，加入沉淀劑可保證溶液在冷藏條件下較長的時間保持澄清透明。

2.2 方法學(xué)性能考察

2.2.1 方法的線性和檢出限

將間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋至0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1、5、10 μg/mL，并依次注入液相色譜儀，以峰面積和測試液濃度做曲線。檢出限和定量限為色譜圖信噪比(S/N)等于3和10時所對應(yīng)的樣品中間苯二酚的含量。兩種檢測器的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。結(jié)果顯示兩種檢測器在各自的線性范圍內(nèi)線性良好，且熒光檢測器的靈敏度更高。

表2 兩種檢測器的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.2.2 方法的準(zhǔn)確性與精密度

選取小麥粉及其制品(自發(fā)粉、鮮面條、干面條、饅頭、裹粉和油條)，分別加入一定量的間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限，每個水平平行測定6次，考察方法的回收率及精密度并對比兩種檢測器共有的線性范圍內(nèi)的(加標(biāo)水平為1 mg/kg和2 mg/kg)樣品的PDA定量結(jié)果和熒光定量結(jié)果。

加標(biāo)量為0.05、0.1、和0.5 mg/kg的樣品以熒光檢測器的定量結(jié)果來計算回收率，加標(biāo)量為1、2和10 mg/kg的樣品以PDA檢測器的定量結(jié)果來計算。小麥粉樣品的回收率在90.3%～103.2%之間，其他樣品的回收率也均在73%～108.6%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.2%。結(jié)果見表3。

在GB 27404—2008檢測方法的確認(rèn)要求中規(guī)定，加標(biāo)量在1～10 mg/kg之間，回收率范圍為90%～110%；在0.1～1 mg/kg之間，范圍為80%～110%；加標(biāo)量<0.1 mg/kg時，回收率范圍在60%～120%之間。本方法的回收率除加標(biāo)水平為0.05 mg/kg的樣品的回收率在60%～120%之間外，其他加標(biāo)水平的樣品的回收率均在90%～110%之間。GB 27404中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)隨待測組分含量的增加而減小，當(dāng)待測組分的含量為0.1 mg/kg時RSD<15%，10 mg/kg時RSD<7.5%,方法最低加標(biāo)量0.05 mg/kg的RSD為4.5%～8.2%,其他加標(biāo)水平的RSD<5.5%。結(jié)果表明，方法的回收率和精密度均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。加標(biāo)水平為1 mg/kg和2 mg/kg的每一個樣品的PDA定量結(jié)果和熒光定量結(jié)果經(jīng)過比對，其偏差的絕對值均小于5.2%，差異較小。

表3 不同樣品添加回收率與精密度

2.2.3 方法的特異性

為考察方法的特異性，對空白樣品和加標(biāo)樣品按照相同的前處理和儀器條件進(jìn)行分析，得到的譜圖(圖4)表明，在間苯二酚保留時間處沒有明顯的干擾峰。實(shí)驗(yàn)還考察了間苯二酚兩種同分異構(gòu)體鄰苯二酚和對苯二酚對目標(biāo)物的干擾情況，發(fā)現(xiàn)在本方法建立的流動相條件下，三種同分異構(gòu)體能有效分離，其分離色譜圖見圖5。綜上，方法的特異性較強(qiáng)，有效避免了復(fù)雜基質(zhì)中假陽性的影響。

圖4 間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、空白樣品和空白樣品加標(biāo)色譜圖

圖5 苯二酚三種同分異構(gòu)體的分離色譜圖

2.3 方法的應(yīng)用

方法的檢測器采用二極管陣列和熒光檢測器串聯(lián)，間苯二酚測試液濃度在兩者共同的線性范圍內(nèi)時兩種檢測器可以同時用于定量，差別不大，在定性時根據(jù)目標(biāo)峰在兩個檢測器采集的譜圖的同一保留時間處是否同時出現(xiàn)相互佐證；測試液濃度超出熒光檢測器的線性范圍但在PDA檢測器的線性范圍之內(nèi)的可用PDA定量，目標(biāo)物的紫外吸收光譜圖和熒光檢測器的譜圖輔助定性，或者稀釋至兩種檢測器共同的線性范圍；熒光檢測器靈敏度高，適用于含量<1 mg/kg的樣品的檢測，但濃度低于PDA的檢出限時，定性方式也較單一。

對購買自超市和網(wǎng)絡(luò)兩種渠道不同品牌的小麥粉、面條、饅頭等樣品共計50批次，按本方法建立的前處理方法進(jìn)行處理與上機(jī)測定，未發(fā)現(xiàn)間苯二酚陽性樣品。

3 結(jié)論

本方法建立了高效液相色譜-PDA-熒光串聯(lián)法測定小麥粉及其制品本方法中間苯二酚的含量，二極管陣列和熒光檢測器的定量結(jié)果均具備良好特異性，且在各自線性范圍內(nèi)r2>0.999，定量限分別為1 mg/kg和0.05 mg/kg，回收率73.0%～108.6%，RSD<8.2%，兩種檢測器的定量結(jié)果偏差<5.2%。方法操作簡單、線性良好、準(zhǔn)確度高，兩種檢測器串聯(lián)使用，增加了定性定量的準(zhǔn)確性。該方法為小麥粉及其制品的監(jiān)管和風(fēng)險監(jiān)測提供有效的技術(shù)支持，也為今后小麥粉及其制品加工過程中間苯二酚含量變化趨勢研究提供參考。