響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒大麥芽黃酮提取工藝的研究

米 智 武曉紅 劉荔貞

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，大同 037009) (山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院2，大同 037009)

大麥(HordeumvulgareL.)屬禾本科一年生草本植物，是世界上最主要、最古老的栽培作物之一[1]，一直被認為是重要的谷物之一，中國大麥種植面積和總產(chǎn)量居水稻、小麥、玉米和粟之后，列第五位[2]。其產(chǎn)量在世界糧食作物中居第4位，僅次于小麥、水稻和玉米[3]。

大麥不僅是重要的糧食作物，還是藥用植物、飼料作物和釀酒作物，尤其麥芽具有多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床。大麥籽粒營養(yǎng)成分豐富、全面，含有高纖維、高維生素、低脂肪、低糖、多種微量元素以及β-葡聚糖、α-生育三烯醇、黃酮、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、抗性淀粉[4]、多酚、黃酮、類黃酮等功能成分[5，6]。大麥中纖維具有低血糖指數(shù)，對糖尿病患者日常生理功能維持有益[7]。大麥還富含β-葡聚糖等植物化學(xué)物質(zhì)，其在預(yù)防心血管疾病(CVD)[8]、癌癥[9]和肥胖等常見營養(yǎng)相關(guān)疾病[10]方面有著極其重要的作用。由大麥制成的全麥食品被認為是人類的“健康食品”[11]。

大麥麥芽為中醫(yī)臨床上常用的一味消食藥，是由成熟大麥果實經(jīng)發(fā)芽干燥而得。用水浸泡麥粒，保持適宜溫、濕度，待3～6 d幼芽長至約0.5 cm時，進行干燥即得生麥芽。《中國藥典》載：麥芽甘平行氣消食、健脾開胃、退乳消脹，用于食積不消、脾虛食步、乳汁郁積、乳房脹痛、婦女?dāng)嗳椤⒏挝笟馔碵12]。麥類麥芽中含有豐富的黃酮類化合物、麥芽酚、麥角類化合物、β-葡聚糖、尿囊素、淀粉酶、α-生育三烯酚、轉(zhuǎn)化糖酶、催化酶、過氧化異構(gòu)酶等。另含α-科醌、大麥芽堿、大麥芽胍堿、腺嘌呤、膽堿、蛋白質(zhì)、氨基酸，維生素B、D、E，細胞色素等[13-16]。研究發(fā)現(xiàn)，大麥在發(fā)芽過程中，可分解一些抗營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生新物質(zhì)或增加已有營養(yǎng)物質(zhì)的含量[1]，有助于大麥營養(yǎng)物質(zhì)的富集，并且可以極大地提高各種酶的活性，使其保健功效發(fā)揮更充分[17]。Kanauchi等[18-20]研究表明，發(fā)芽大麥具有改善通便、防治腹瀉功效，還對結(jié)腸炎有較好的預(yù)防和治療作用。

大麥芽中含量豐富的黃酮類化合物是中藥等領(lǐng)域的研究熱點，其黃酮類成分主要有兒茶素、蘆丁、橙皮甘、楊梅素、槲皮素和山柰酚[21]等，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌防癌等方面的功能[13,22,23]，也能降低血管的脆性及異常的通透性作用，可用作防治高血壓及動脈硬化的輔助治療劑，其中兒茶素還具有抗肝臟毒作用，黃酮類化合物二氫槲皮素具有抗炎作用等[24]，麥芽中含有的麥黃酮還有改善記憶，治療老年癡呆癥的功能[25]。麥芽中的類黃酮，對DNA修復(fù)有一定的作用[13]。

大麥資源雖在我國非常豐富，但多集中于品種篩選、種植栽培等方面，而對大麥尤其大麥芽的功能特性、醫(yī)療保健、及其深加工等方面的研究和利用還不夠深入。黃酮的提取方法很多，其中索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設(shè)備、操作簡便等優(yōu)點，適于實驗室應(yīng)用；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無毒且沸點低，適于索氏提取法對黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑時回收利用方便，得率高，有利于降低生產(chǎn)成本[26]。本研究以啤酒大麥芽為研究對象，利用響應(yīng)面實驗探究索氏提取法提取大麥芽黃酮的最佳工藝條件，為大麥芽黃酮的藥用研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒大麥芽，蘆丁標準品，無水乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋、酸度計、精密電子天平，真空抽濾裝置、數(shù)顯恒溫水浴鍋、紫外/可見分光光度計，高速中藥粉粹機，索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的建立

準確稱取蘆丁標準品10 mg，加少量乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標準液[27]。

取6個干燥潔凈的25 mL容量瓶，蘆丁標準曲線的制作見表1。

表1 蘆丁標準曲線的制作

以0號容量瓶為空白對照，在510 nm處用紫外/可見分光光度計測定吸光值，測3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 大麥芽處理及黃酮提取工藝流程

選擇無發(fā)霉、無機械傷、無病蟲害、顆粒飽滿的大麥芽種子，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用萬能粉碎機粉碎成大麥芽粉末，并使大麥芽粉通過60目篩，收集大麥芽粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程為：大麥芽→清選→烘干→粉碎→過篩→稱重→分裝小包→乙醇提取浸提→提取液定容→測定吸光值→計算提取量

1.3.3 大麥芽總黃酮的測定方法

精確量取1 mL提取液做為待測液，方法同1.3.1，在510 nm處測吸光值，做3組平行實驗求平均值，代入線性回歸方程，得到大麥芽總黃酮的含量公式：

式中：C為大麥芽總黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；W為實驗樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實驗[28]

1.3.4.1 乙醇濃度

準確稱取2 g大麥芽粉末，在料液比(g/mL)為1∶15、提取時間為1 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，并計算黃酮提取量。

1.3.4.2 料液比

準確稱取2 g大麥芽粉末，在乙醇體積分數(shù)為60%、提取時間為1 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測定吸光值，并計算黃酮提取量。

1.3.4.3 提取時間

準確稱取大麥芽粉末2 g，在乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶15、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置提取時間為1、1.5、2、2.5、3 h提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測定吸光值，并計算黃酮提取量。

中國書畫千年歷史，不能斷了香火，后輩學(xué)子首先是在老祖宗靈位前嗑頭下跪，老老實實把老師那點東西學(xué)到手，添油加柴，把家傳本領(lǐng)好好學(xué)到家。

1.3.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及統(tǒng)計學(xué)處理方法

根據(jù)大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實驗結(jié)果，從乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)和提取時間(C)3個因素中，分別選取3個對大麥芽總黃酮提取量影響最大的水平，以黃酮提取量為考察目標，運用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，確定相應(yīng)面試驗方案，并建立回歸方程預(yù)測模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 大麥芽總黃酮提取工藝的驗證性實驗

為了更好的證實索氏提取法提取大麥芽總黃酮的可靠性和合理性，在響應(yīng)面實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行了3次平行驗證性實驗，并計算相對標準偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁濃度為橫坐標，吸光值OD510為縱坐標，制作標準曲線，得出線性回歸方程為：y=9.107x-0.112，R2=0.993。

2.2 大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實驗結(jié)果

由圖1可以得到，當(dāng)乙醇體積分數(shù)低于60%時，大麥芽黃酮提取量隨乙醇濃度增大而提高，在乙醇體積分數(shù)為60%時黃酮提取量達到最大，約為56 mg/100 g，當(dāng)乙醇體積分數(shù)超過60%后，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面實驗時，選取乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%。

圖1 乙醇濃度、回流時間和料液比對大麥芽黃酮提取量的影響

大麥芽黃酮提取量隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1∶15時，大麥芽黃酮提取量達到最大值，約為55 mg/100 g，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面試驗時，選取料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20。

當(dāng)提取時間不足2 h時，大麥芽黃酮提取量隨提取時間延長而提高，且提取2 h時黃酮提取量達到最大值，約為58 mg/100 g，隨著提取時間的延長，大麥芽黃酮提取量反而有所降低，因此在做響應(yīng)面試驗時，選取提取時間分別為1.5、2、2.5 h。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面分析因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平

響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

建立啤酒大麥芽黃酮提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實驗評價指標(黃酮提取量)的響應(yīng)值對自變量A(乙醇濃度)、B(料液比)和C(提取時間)的二次多項式回歸方程：黃酮提取量=-372.525+9.757 5×A+2119×B+76.6×C+6×AB+0.45×AC+180×BC-0.093 5×A2-18 960×B2-30.4×C2。

回歸模型方差分析見表4。

表4 回歸模型方差分析

以啤酒大麥芽黃酮提取量為評價指標對該模型進行方差分析及模型系數(shù)進行顯著性檢驗(表4)。回歸模型在統(tǒng)計學(xué)上呈極顯著(P=0.00 63<0.01)，說明實驗?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計學(xué)意義；且通過P值可知模型中變量A2、B2、C2對提取量影響顯著，說明實驗因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對相應(yīng)值有很大的關(guān)系，三因素的交互作用影響相對較小；失擬項P=0.595 8>0.05，不顯著，說明實驗?zāi)Ｐ蛿M合度較好，模型的殘差可能來源于實驗過程的隨機誤差。模型的校正決定系數(shù)R2=0.910 1，說明實驗誤差較小，有91.01%來解釋該模型中響應(yīng)值的變化。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對響應(yīng)值的影響順序為：提取時間(C)>乙醇濃度(A)>料液比(B)，但這3個因素均對黃酮提取量影響均不顯著(P>0.05)。

通過三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著乙醇濃度、料液比和提取時間的增大或延長，啤酒大麥芽黃酮提取量也隨之增大，但當(dāng)濃度、料液比和提取時間增大或延長到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢，三因素之間的交互作用不顯著，等高線圖中的橢圓程度和疏密程度也相當(dāng)，與模型回歸中的方差分析一致。

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面法試驗分析數(shù)據(jù)可得出啤酒大麥芽中黃酮最佳提取取工藝為：乙醇體積分數(shù)為59.18%、料液比為1∶14.2 9、提取時間為1.92 h，最佳提取量為68.43 mg/100 g。考慮實驗室操作的可行性，修正提取工藝條件乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶15、提取時間為2 h。

2.5 優(yōu)化條件的驗證性實驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗篩選出大麥芽黃酮提取最佳工藝，進行3組平行實驗，驗證響應(yīng)面實驗結(jié)果的可靠性和準確性。驗證性實驗測定大麥芽黃酮提取量見表5。3組平行樣數(shù)據(jù)RSD為3.83%，滿足要求，得出該提取工藝大麥芽黃酮提取量較為穩(wěn)定。

表5 驗證性實驗測定大麥芽黃酮提取量

3 結(jié)論

由響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析可知，索氏提取法提取大麥芽黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶15和提取時間為2 h。影響程度為：提取時間>乙醇濃度>料液比，3個因素對大麥芽黃酮提取量影響不顯著。通過驗證性實驗可知，該工藝黃酮提取量最高，相對標準偏差較小(3.83%)，響應(yīng)面實驗?zāi)軐Ω鱾€因素及各因素之間的交互分析更全面，更細致，較為準確地分析出因素間最佳組合，實驗穩(wěn)定可靠。