玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維膜制備及其性質研究

鄧伶俐 張 輝

(湖北民族大學生物科學與技術學院；生物資源保護與利用湖北省重點實驗室；超輕彈性體材料綠色制造國家民委重點實驗室1，恩施 445000) (浙江大學生物系統工程與食品科學學院;浙江省農產品加工技術研究重點實驗室;浙江省食品加工技術與裝備工程中心2，杭州 310058)

靜電紡絲技術利用高壓電場將高分子溶液牽拉向低電勢方向伸展形成納米級或微米級的纖維并沉降于接收端。靜電紡絲納米纖維被認為在許多領域具有巨大的應用潛力，如生物醫藥、過濾吸附、化妝品、食品等領域[4]。靜電紡絲納米纖維在食品行業的應用剛剛起步，由于納米纖維具有直徑小、比表面積大，結構可控等優點，在生物活性物質載運、活性包裝、環境響應性釋放等方向具有良好的應用前景[5]。由于食品行業對安全性及可降解性的要求，越來越多的研究者關注到天然高分子納米纖維的制備及改性的工作[6]。

通常將天然高分子納米纖維膜進行應用研究均需要對其進行交聯，可以通過化學法或者酶法交聯[7, 8]。最常見的交聯方式是戊二醛熏蒸[9, 10]，但是研究表明戊二醛殘留具有細胞毒性[11, 12]。考慮到交聯劑的毒性可能對后期應用在食品行業有不利影響，必須選擇更加安全的交聯方式。前期研究表明通過將明膠與玉米醇溶蛋白混合靜電紡絲可一定程度改善單一組分納米纖維膜的機械性能和溶劑穩定性，但其對納米纖維膜綜合性能提升效果還不足以將其實際應用。近期研究表明通過添加葡萄糖誘導的美拉德反應能夠提升天然高分子納米纖維膜的綜合性能[13, 14]。

已有研究表明通過向納米纖維中添加無機物能夠顯著提升其綜合性能，改善其機械性能，改變納米纖維膜的親疏水性。Mirmusavi等[15]發現向聚3-羥基丁酸酯/殼聚糖/絲素蛋白復合納米纖維中添加碳納米管能將其拉伸強度從41.18 MPa增加至46.68 MPa。en等[16]研究表明氮化硼納米管顯著提升了明膠納米纖維的拉伸強度，從0.48 MPa增加至0.77 MPa。Ngiam等[17]向PLGA納米纖維中添加納米羥基磷灰石發現其接觸角從75.9°增加至107.5°，而PLGA/膠原蛋白納米纖維膜的接觸角從54.6°降低至11.2°。Ao等[18]發現添加5%納米羥基磷灰石到乙基纖維素納米纖維膜中能夠將其拉伸強度從52.9 MPa提升到70.9 MPa。研究發現納米羥基磷灰石增加了PLA纖維膜和PU膜的親水性[19, 20]。

本研究旨在通過添加納米羥基磷灰石到玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維中制備三元復合納米纖維體系并改善納米纖維膜的機械性能和浸潤性。通過掃描電子顯微鏡和透射電鏡觀察納米纖維微觀形態變化以及納米羥基磷灰石在納米纖維中的分布。通過傅里葉紅外光譜研究組分間的分子間相互作用以及蛋白二級結構的變化。通過接觸角測試表征納米纖維膜浸潤性的變化，并通過表面元素分析其親疏水基團比例。通過拉伸測試來研究納米羥基磷灰石對復合膜機械性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米醇溶蛋白(Z3625)、明膠(藥用級)、納米羥基磷灰石(純度≥97%，顆粒直徑<100 nm)；葡萄糖、乙酸均為分析純。

JDF05型靜電紡絲機，MCR302旋轉流變儀， SU8010掃描電子顯微鏡，170-SX傅里葉紅外光譜儀，Q200差示量熱掃描儀，Q500熱重分析儀，Q800動態機械分析儀，X-pert PowderX射線衍射儀，OCA-20視頻接觸角測試儀，AXIS SUPRA 型X射線光電子能譜儀，AGS-J萬能測試機。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制及流變性測試

將玉米醇溶蛋白(2.25 g)，明膠(0.75 g)，葡萄糖(0.5 g)溶于 10 mL 80%乙酸溶液，然后分別加入納米羥基磷灰石0、0.3、0.75、1.5 g，對應相比于總蛋白量的質量濃度0、10%、25%、50%，分別簡寫為HAP0、HAP10、HAP25、HAP50。攪拌12 h使其充分溶脹。

將溶液利用旋轉流變儀選用CP50錐板進行旋轉測試和振蕩測試。在25 ℃下設置剪切速率為0.1～1 000 s-1，測定黏度隨剪切速率的變化。溶液的振蕩測試頻率范圍為0.1～100 rad/s，測定溶液的彈性模量和損失模量隨振蕩頻率的變化。

1.2.2 靜電紡絲過程

靜電紡絲裝置如圖1，首先將高分子溶液吸入5 mL塑料注射器中，通過注射泵以1.0 mL/h的速率進行推進，前端針頭直徑為0.06 mm的不銹鋼平頭點膠針(20 G)。靜電紡絲過程電壓控制在15 kV，針頭至轉鼓接收端的距離為10 cm。濕度為40%～60%，溫度為20～25 ℃。將得到的納米纖維膜在140 ℃條件下處理3 h以達到美拉德交聯的目的[13]。

圖1 靜電紡絲裝置示意圖

1.2.3 掃描電鏡分析

剪取納米纖維膜，經真空噴金處理后，于掃描電子顯微鏡上觀察納米纖維的微觀形貌。使用軟件Nano Measure從納米纖維的掃描電子顯微鏡圖中選取3張放大倍數為5 000倍的電鏡圖，每張圖隨機選取40根纖維，對其直徑進行統計，根據所得數據計算得出纖維平均直徑并作直徑分布直方圖。

1.2.4 納米纖維膜表征

采用傅里葉變換衰減全反射法進行紅外光譜掃描，掃描范圍為：4 000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1，累加32次，以空氣為背景，每次掃描前扣除背景。用軟件Peak Fit v4.12擬合譜圖中的酰胺I帶。首先進行基線校準，然后通過二階導數進行擬合，完全分辨開不同的譜帶。每個子峰的面積占所有峰總面積的比值就是該峰所對應的構象的含量所占的比值。

采用接觸角測量儀測定水接觸角。將樣品固定在載玻片上，采用去離子水作為探針溶劑在室溫下進行測量。每個樣品重復測量3次。

采用X射線光電子能譜儀用于分析膜表面元素。光源為Al Kα X射線光源 (1 486.6 eV)。寬掃范圍為0～1 000 eV，掃描頻率為1.0 eV。精細掃描的頻率為0.1 eV。采用Origin pro9軟件擬合C1s精細掃描光譜圖。以284.8 eV作為C―C/C―H的特征峰，進行光譜校正[21]。

將電紡膜剪成2 cm× 2 cm的片狀，在X-pert Powder衍射儀上進行檢測分析，CuKα(λ = 1.540 6 ?)，傾角0.02°，掃描速度1°/min，掃描范圍2θ=5°～90°，電壓40 kV，電流200 mA。

將電紡膜(厚度約0.1 mm)剪成1 cm × 4 cm條狀，利用AGS-J萬能測試機進行力學性能測試。將纖維膜放入夾具，輸入樣品精確的寬度、長度、厚度，拉伸載荷為5 N，拉伸速率為1 mm/min，每個樣品重復5次。

1.3 數據分析

統計學分析使用t分布檢驗單因素方差分析(ANOVA one way)，后續使用Tukey分析進行檢驗，分析軟件為Origin 8.0。當P<0.05時，結果被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 流變性質分析

圖2為玉米醇溶蛋白/明膠及含不同濃度納米羥基磷灰石(nHAP)的溶液黏度隨著剪切速率的變化圖。可以看出所有溶液都為剪切變稀溶液，這是由于高分子纏聯網絡在高剪切速率的條件下被破壞。高分子纏聯網絡被破壞和重構的過程無法達到平衡，最后無法抵御剪切力的作用發生剪切變稀的現象[22]。表1為根據冪定律進行擬合得到的結果。當n小于1時說明溶液為剪切變稀非牛頓流體，研究表明適當的剪切變稀現象時有助于靜電紡絲過程順利進行的[23, 24]。隨著nHAP含量的增加，溶液的黏度增加，但是其剪切變稀現象更明顯。說明nHAP與蛋白之間發生了相互作用，增加了分子間的摩擦，從而黏度增加[25]。

圖2 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石溶液的旋轉測試剪切速率-粘度曲線

通過對溶液進行振蕩測試頻率掃描發現儲存模量(G′)和損失模量(G″)均隨著振蕩頻率的增加而增加。所有溶液都能夠觀察到G′和G″的交叉點，說明其既具有黏性也具有彈性，分子網絡進行了有效纏聯，有利于靜電紡絲的進行[26]。而G′和G″的交叉點隨著nHAP含量的增加，交叉點向高頻率移動。已有研究表明G′和G″的交叉點能夠反映溶液中的纏聯密度，而交叉點向高頻率移動說明了纏聯密度的降低，這與剪切測試中更顯著的剪切變稀現象所對應[18, 27]。

表1 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石溶液旋轉切速率-剪切應力圖冪定律擬合結果

圖3 玉米醇溶蛋白/明膠(3∶1，m/m)納米纖維(HAP0)含有10%(HAP10)、25% (HAP25)、50% (HAP50) 羥基磷灰石的納米纖維電鏡圖和直徑分布

2.2 納米纖維形態分析

圖3為含有不同nHAP濃度的納米纖維的形態及直徑分布。玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維直徑為112 nm，而HAP10、HAP25、HAP50納米纖維的直徑分別為248、249、220 nm。nHAP的加入顯著增加了玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維的直徑，但不同濃度之間沒有顯著差異。從HAP10納米纖維的透射電鏡圖可以看出nHAP分布在纖維內部，也有一部分nHAP分布在內部和表面，導致纖維表面粗糙。

研究表明黏度變化是影響纖維形態的重要因素，大多數研究表明黏度增加會引起纖維直徑的增加[28]。nHAP的加入顯著增加了溶液的黏度導致了纖維直徑的增加。但是同時nHAP的加入會增加溶液的電導率，增強纖維的牽伸導致。不同nHAP濃度的溶液雖然黏度隨著nHAP濃度增加逐漸增加，但是電導率的增加又一定程度的中和了黏度增加的作用，因此添加了不同濃度nHAP的玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維直徑無顯著差異。

2.3 紅外光譜分析

圖4 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維紅外光譜圖

圖5 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維中蛋白二級結構比例

圖6 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維接觸角

2.4 接觸角及表面元素分布

圖6為復合納米纖維膜接觸角測定結果。玉米醇溶蛋白/明膠復合納米纖維膜具有疏水的表面，與前期研究結果一致。隨著浸潤時間的延長，接觸角稍有降低，從136°降低到131°。nHAP的加入對接觸角的影響不大，隨著nHAP含量的增加，3 s時的接觸角隨著濃度增加從134°增加到了141°。隨著浸潤時間延長HAP10和HAP25接觸角降低幅度與HAP0無顯著差異，但是HAP50在60 s時接觸角降低到了124°，說明其浸潤性顯著增加，可能是由于nHAP結節以及表面粗糙度增加引起了納米纖維膜網絡結構的疏松，更有以利于水分的浸潤。研究表明疏水的表面可能更有利于纖維膜的抗生物膜形成。Grenho等[32]研究表明nanoHA1000(1 000 ℃處理)由于具有更疏水的表面相比于nanoHA750(750 ℃處理)更能夠抵御細菌的粘附。

納米纖維膜表面元素通過XPS分析得到。圖7a為玉米醇溶蛋白/明膠/nHAP典型的XPS寬掃譜圖，除了C、O、N的峰之外，Ca峰和P峰出現在347.2 eV和133.3 eV，說明nHAP也暴露在表面。圖7b為表面各元素比例，其中Ca和P元素的比例是遠小于其在纖維膜中的質量比的，說明大部分的nHAP是分布在纖維的內部，少量暴露于纖維表面的。隨著10% nHAP的加入，O元素比例從34.1%降低到31.5%，而隨著nHAP含量繼續增加，O元素比例又上升至34.5%和35.4%。HAP25和HAP50樣品含有相對較高含量的N元素和相對較低含量的C元素。

圖7 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石XPS寬掃譜圖(a)和元素比例(b)

圖8 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維基團分布

2.5 機械性能分析

表2為根據納米纖維膜應力-應變圖得出的彈性模量，拉伸強度和斷裂伸長率結果。結果表明隨著nHAP含量的增加，納米纖維膜的彈性模量、拉伸強度和伸長率均降低。已有研究表明由于nHAP在纖維中的聚集和結節會引起纖維膜機械性能的下降[36]。Samadian等[37]也發現nHAP添加到乙基纖維素/明膠納米纖維中會引起機械性能的下降。Ni等[38]也發現低濃度的nHAP能夠一定程度的提升PVA納米纖維膜的機械性能，高濃度的nHAP降低了高分子網絡結構的連續性，從而導致更差的機械性能。

表2 玉米醇溶蛋白/明膠/羥基磷灰石納米纖維拉伸測試彈性模量，拉伸強度和斷裂伸長率

3 結論

制備了美拉德反應交聯的玉米醇溶蛋白/明膠/納米羥基磷灰石復合納米纖維。nHAP顯著增加了玉米醇溶蛋白/明膠復合納米纖維的直徑，歸因于納米羥基磷灰石引起的黏度增加。nHAP與蛋白之間通過氫鍵相互作用。當nHAP添加濃度為10%時引起了蛋白二級結構從β-折疊向轉角結構的轉變，此時由于納米纖維膜表面極性基團比例的下降其疏水性增加浸潤性下降。而當nHAP添加量為50%時其接觸角由于極性基團比例的增加顯著降低。但是nHAP的添加對于玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維膜的機械性能沒有提升作用，反而其彈性模量和拉伸率均隨著nHAP的加入而降低，歸因于剛性的nHAP加入降低了蛋白分子網絡的彈性和連續性。本研究表明向玉米醇溶蛋白/明膠納米纖維中添加10%的納米羥基磷灰石能夠提升復合納米纖維膜的疏水性，降低其被水分浸潤的速率，使其應用在食品包裝領域的可操作性更好。