7種蕓豆中酚類化合物組成及其抗氧化活性

王何柱 朱 勇 朱 怡 何友勛 秦禮康 梁亞麗

(貴州大學釀酒與食品工程學院1，貴陽 550025) (貴州省植保植檢站2，貴陽 550001) (畢節市農業科學研究所3，畢節 551700)

蕓豆(PhaseolusvulgarisL.)是豆科菜豆屬一年生草本植物的籽粒，原產于南美洲，我國在16世紀末開始種植栽培，其豆莢和種子被廣泛食用，尤其是在亞洲國家[1]。蕓豆不僅含有人體必需氨基酸、蛋白質、維生素、膳食纖維等營養成分，而且也是酚類物質、黃酮等功能成分的重要來源[2，3]。很多研究表明人的機體衰老與自由基的產生密切相關，而酚類物質有較強的清除自由基的能力[4]。李思荻等[5]研究發現各種豆類的還原能力與總黃酮和總酚的含量呈正相關，并且這兩種物質能有效的清除羥基自由基。鞏藹等[6]證實云南的8種豆類中酚類物質質量分數大于0.1%，并且類黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力都大于69%。Madhujith[7]研究結果表明，有色種皮豆類顯示出較好的自由基清除能力。趙艷等[8]研究小扁豆、紅蕓豆、鷹嘴豆等雜豆時，發現他們的總酚黃酮含量豐富。目前，國內對雜豆和蕓豆的抗氧化活性已有一定的研究，但對不同顏色蕓豆中的酚類化合物組成和抗氧化活性的差異研究較少。本實驗以7種不同花色蕓豆為原料，研究其酚類化合物組成及抗氧化活性，為蕓豆深加工提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢蕓Ⅱ1、英國紅、龍12-2614、科蕓1號、天鎮黃蕓豆、畢蕓2015-1、畢蕓2號7種蕓豆的顏色分別為黑、紅、白、白花、黃、紅花、黑紅色。7種蕓豆的產地為貴州省畢節市，由貴州省畢節市農科所提供。用粉碎機將蕓豆粉碎后，全部通過30目鋼篩并存儲在-20 ℃保存。

6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基、福林酚、蘆丁、2,2’-聯氮雙-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二胺鹽、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪均為分析純；3,4,二羥基苯甲酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸為色譜純。

1.2 儀器與設備

RE-2000B型旋轉蒸發儀，H2-16KR型臺式高速冷凍離心機，L5S紫外可見分光光度計，TS-100C恒溫搖床，SpectraMax190 光吸收酶標儀，1260 Infinity高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 酚類提取物的制備

參考Adom等[9]的方法并略作修改，將1 g的樣品與20 mL的冷凍丙酮(80%)混合后，放在振蕩器震蕩10 min，然后在8 500 r/min下離心10 min。收集上清液并重復提取兩次，將收集的上清液倒入燒瓶中并在45 ℃的旋轉蒸發器中旋蒸至10 mL左右，然后用蒸餾水定容到25 mL，得到游離態酚類物質。

1.3.2 總酚含量測定

參考Singleton 等[10]的方法并稍加改進。采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚含量，準確移取100 μL的提取液和沒食子酸標準溶液至試管中，之后加入400 μL蒸餾水和100 μL的福林酚試劑，混勻靜置6 min后加入1 mL 7%的碳酸鈉溶液和0.8 mL的蒸餾水，避光反應2 h后，以蒸餾水代替樣品做空白，在760 nm波長處用酶標儀測定吸光度，結果以每克干基中所含沒食子酸當量(GAE)的質量表示(mg GAE/g DW)。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照Bakar等[11]的方法進行。準確吸取0.5 mL的提取液或蘆丁標準溶液，分別加入2.25 mL的蒸餾水和0.15 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，反應6 min后加入0.3 mL 10%的氯化鋁溶液，震蕩混勻靜置5 min，加入1 mL 1mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻后在510 nm波長處測定吸光度。以蒸餾水替代提取液作對照。每個處理重復3次，結果以每克干基中所含蘆丁當量(RE)的毫克數表示(mg RE/g DW)。

1.3.4 酚類化合物組成分析

參考Irmak和Ti等[12，13]的方法，吸取提取物1 mL并過0.45 um的濾膜，各樣品的分析采用Agilent Technologies 1260 infinity 系統，ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 um)。HPLC的總運行時間為50 min，梯度洗脫的程序如下：0～5 min，5%～15% A；5～35 min，15%～35% A；35～40 min，35%～45% A；40～50 min，45%～5% A。檢測器為紫外吸收檢測器(UVD)，檢測波長為280 nm，柱溫30℃，流動相A為乙腈，流動相B為1%的冰乙酸溶液，流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.5 抗氧化活性測定1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Pawel[14]等的方法，分別吸取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 mL 0.1 mg/mL 的Trolox標準溶液于容量瓶中，然后加入4 mL 0.1 mmol/L 的DPPH溶液，加無水乙醇定容至5 mL。混勻靜置30 min，用紫外分光光度計在517 nm波長處測定吸光度值并繪制標準曲線。吸取0.1 mL的提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L 的DPPH溶液，用無水乙醇定容至5 mL。混勻靜置30 min，用紫外分光光度計在517 nm波長處測定吸光度值。以蒸餾水代替樣品做空白，DPPH自由基清除能力以mg Trolox標準物質/g豆類干物質表示(mg TE/g DW)。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考Arnao等[15]的方法。首先配制7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液并將兩者等體積混合，在室溫黑暗條件下反應12 h得到母液。吸取1 mLABTS母液，加入22 mL甲醇進行稀釋，使吸光度達到(1.1±0.02)。準確吸取150 μL稀釋8倍的提取液和Trolox標準溶液，加入2 850 μL的ABTS溶液，在黑暗條件下反應2 h，用紫外分光光度計在734 nm波長處測定吸光度值。以蒸餾水代替樣品做空白，結果以每克干基中所含Trolox當量(TE)的微摩爾數表示(μmol TE/g DW)。

1.3.5.3 鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)測定

參考Benzie等[16]的方法。取150 μL稀釋9倍的提取液或Trolox標準溶液與2 850 μL的FRAP溶液(300 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液∶20 mmol/L FeCl3∶10 mmol/LTPTZ=10∶1∶1混勻，在37 ℃反應10 min，用酶標儀在593 nm波長處測定吸光度值。以蒸餾水代替樣品做空白，結果結果以每克干基中所含Trolox當量(TE)的微摩爾數表示(μmol TE/g DW)。

1.4 數據分析

每組實驗均重復3 次，通過Excel統計數據，采用Origin9.0進行繪圖，并使用SPSS 16.0軟件分析數據，采用Duncan多重檢驗法進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果分析

2.1 7種蕓豆的總酚和總黃酮含量

從表1中可以得出7種蕓豆的總酚含量在0.91～4.96 mg GAE/g DW，其中黑色蕓豆的總酚含量最高，白色蕓豆的最低。趙艷等[8]研究小扁豆、紅蕓豆、鷹嘴豆等雜豆時，得出3種蕓豆的總酚含量為9.05～13.48 mg GAE/g，明顯大于本研究結果，可能是原料和產地的不同導致。從表1中可以看出黑色蕓豆的總酚含量大概為白色蕓豆的5倍，深色蕓豆的酚類含量要明顯高于淺色蕓豆，Xu等[17]通過對9種豆類的抗氧化活性研究，同樣也得出黑色豆皮蕓豆的酚類物質含量比其他顏色豆類的要高，這與本實驗結論一致。Xu等[18]在研究中得出紅小豆和紅蕓豆的含量分別為12.5、6.85 mg/g，高于實驗中英國紅的總酚含量(3.96 mg GAE/g)。Amarowicz等[17]的研究中紅小豆、蠶豆、扁豆的總酚含量要高于本實驗。

由表1看出，紅花色蕓豆的總黃酮最高，其次分別為白花色、紅色、黑色、黃色、黑紅色、白色蕓豆的含量最低。李思荻等[5]在研究幾種黑龍江種植豆類中，以兒茶素做為標準品測得黑豆、紅小豆、蕓豆、白蕓豆的黃酮含量分別為0.295 1～2.152 8、0.069 4～1.475 7、0.086 8～1.909 7、0.191 0～0.625 0 mg/g。梁亞靜等[19]在研究黑蕓豆、奶花蕓豆、紫花蕓豆時，測得其黃酮含量范圍為2.4～8.89 mg RE/g DW，在本實驗結果范圍內。趙艷等[8]研究小扁豆、紅蕓豆、鷹嘴豆等雜豆時，三種蕓豆的總黃酮含量為7.78～17.55 mg/g，與本實驗的結果有一點差異，可能是品種的不同導致。Kan等[20]研究中發現白蕓豆中總黃酮含量范圍為0.78～1.33 mg RE/g DW，紅蕓豆總黃酮含量范圍為4.05～5.19 mg RE/g DW，紅色蕓豆的黃酮含量遠高于白色蕓豆，本實驗中英國紅(紅色)的黃酮含量也遠遠高于龍12～2614(白色)，這與本研究結論保持一致。

2.2 7種蕓豆酚類化合物的組成

表2結果表明，綠原酸、3,4,二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸是蕓豆中的主要酚類物質，其中3,4,二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的最高含量都出現在畢蕓Ⅱ1(黑)中，在龍12-2614(白色)蕓豆中只檢測出咖啡酸和3,4,二羥基苯甲酸，并且咖啡酸的含量是7種蕓豆里面最低的，從中我們可以得出深顏色蕓豆中含有較豐富的酚類物質。Xu等[21]在對黑豆種皮中游離態多酚的組成分析中檢測出原兒茶酸，2，3，4-三羥基苯甲酸和香草酸)六種肉桂型酚酸(咖啡酸，綠原酸，m-香豆素、阿魏酸、O—香豆素和反式肉桂酸)其中咖啡酸，綠原酸，反式肉桂酸是種皮中的主要酚酸。造成這種差異的原因可能是品種、農藝措施(灌溉、施肥、病蟲害管理)、成熟度收獲、收獲后儲存和氣候條件不同的影響[22]。Luthria等[23]在研究十五種干食用豆中酚酸含量中得出阿魏酸是所有大豆品種中的主要酚酸，并且得出每100 g干豆樣品中阿魏酸的平均含量為17.8 mg/100 g，在本實驗中阿魏酸只在畢蕓Ⅱ1(黑)和英國紅(紅)兩種蕓豆中檢測出來，并且含量遠遠低于他的結果，這種情況可能是品種的不同的原因。

2.3 7種蕓豆提取物對DPPH自由基清除能力的影響

從圖1中可以得出畢蕓2015-1(紅花色)對DPPH自由基清除能力最強，7種蕓豆對DPPH自由基的清除能力的范圍是0～7.38 mg TE/g DW。龍12-2614在實驗中發現其對DPPH自由基的清除能力為0，也就是說明白色的蕓豆沒有清除能力。Gujral等[24]在研究6種豆類的抗氧化活性中，發現蕓豆具有最高的DPPH自由基率(38.1%)。Xu等[17]研究中發現深色種皮的豆類的DPPH自由基清除能力最強，其中黑大豆的對DPPH自由基的清除率最高，這與本實驗結果有一定的差異，雖然本實驗中畢蕓2015-1(紅花色)蕓豆的DPPH的自由基清除能力最強，但黑蕓豆的DPPH清除能力較其他蕓豆也較高(5.38 mg TE/g DW)。由表1和圖1可以看出，總酚和總黃酮的含量與DPPH自由基清除能力并不完全相關，這與田金河[25]報道的豆類樣品中總黃酮和總酚含量高并不一定對 DPPH·具有高的清除率一致，還說明黃酮類化合物是一類結構相似但種類繁多的化合物，對于清除各個自由基的作用機制各不相同，所以對不同自由基的清除有一定的選擇性。

表1 蕓豆提取物總酚和總黃酮的含量

圖1 蕓豆提取物對DPPH自由基清除的影響

表2 7種蕓豆酚類物質的組成和含量(μg/g DW)

2.4 7種蕓豆提取物對ABTS+自由基清除能力的影響

圖2中顯示，黑蕓豆的ABTS+自由基清除能力最強，其次分別為紅花色、白花色、黑紅色、黃色、紅色、白色蕓豆，7種蕓豆的ABTS+自由基清除能力的范圍是1.42～17.53 μmol TE/g DW。梁亞靜等[19]在研究黑蕓豆、奶花蕓豆、紫花蕓豆中多酚、黃酮含量及抗氧活性時得出紫花蕓豆的ABTS+清除能力為88.47 μmol TE/g DW，她的實驗結果要明顯大于本實驗。Hwa等[26]研究得出幾種豆類的ABTS+自由基清除能力的范圍是1.1～5.61 μmol TE/g，本實驗結果高于該范圍。從表1和圖2可以看出總酚含量較高的畢蕓Ⅱ1(黑)和畢蕓2015-1(紅花)兩種蕓豆，他們對ABTS+自由基清除能力也較強。

圖2 蕓豆提取物對ABTS+自由基清除的影響

2.5 7種蕓豆提取物對鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)的影響

從圖3中可以看出黑色蕓豆和紅花色蕓豆的鐵離子還原抗氧化能力要強于其他顏色蕓豆，其中白色蕓豆的抗氧化能力最弱，7種不同顏色蕓豆的鐵離子還原抗氧化能力的范圍是0.95～9.26 μmol TE/g DW。Xu等[17]研究得出一些豆類的FRAP值，其中黑豆的為1.27～9.93 mmolFe/100 g；黃色大豆為0.13～0.34 mmol Fe/100 g，紅蕓豆為2.85～9.22 mmolFe/100 g，可以看出黑豆的FRAP值明顯大于黃豆，說明了深顏色蕓豆，其抗氧化活性要強，在本實驗中畢蕓Ⅱ1的鐵離子抗氧化能力也明顯強于天鎮黃蕓豆，這與本實驗的結論保持一致。梁亞靜等[19]在研究中發現奶花與紫花蕓豆的FRAP值分別為34.48和42.95 μmol TE/g DW，本實驗的結果明顯低于梁亞靜的實驗結果，可能是由于原料和產地的不同導致。趙艷[8]在研究幾種雜豆的抗氧化活性時，以硫酸亞鐵為標準品測得幾種蕓豆的FRAP值得范圍為461.33～1 008.29 μmol/g，實驗中蕓豆的FRAP值要明顯強于鷹嘴豆。

圖3 蕓豆提取物對鐵離子還原抗氧化能力的影響

2.6 蕓豆種皮提取物中酚類物質、黃酮含量與抗氧化能力的相關性分析

從表3可以看出總酚的含量與3個抗氧化值極顯著相關(P<0.01)，且其相關性大于總黃酮的含量與3個抗氧化值的相關性。Xu等[21]在研究萃取溶劑對豆科植物酚類物質及抗氧化活性影響中發現，當提取溶劑為80%的丙酮時總酚含量與DPPH、FRAP、ORAC之間極顯著相關，并且其相關性要大于黃酮含量與DPPH、FRAP、ORAC的相關性，這與本結果保持一致。梁亞靜等[19]在研究萌發對蕓豆酚類物質及抗氧化活性的影響中得出多酚、黃酮含量與四個抗氧化值(DPPH、ABTS、FRAP、ORAC)極顯著相關，且DPPH與FRAP的相關性最高(r=0.954)，而本研究中DPPH與FRAP的相關性最好(r=0.990)，這可能是提取方式的不同造成的。

表3 蕓豆中總酚、總黃酮及抗氧化值的相關性

3 結論

研究了7種不同花色蕓豆酚類物質的含量以及抗氧化活性，對酚類物質的組成進行分析，并對多酚和黃酮的含量和抗氧化能力做了相關性分析。結果表明，7種蕓豆的總酚含量范圍為0.91～4.96mg GAE/g DW，黃酮的含量范圍為3.29～12.87 mg RE/g DW，其中黑色蕓豆的總酚含量最高。綠原酸、3,4,二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸是蕓豆中的主要酚類物質，其中3,4,二羥基苯甲酸和、對羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的最高含量都出現在黑色的畢蕓Ⅱ1中，可以說明深顏色蕓豆中含有較豐富的酚類物質；DPPH、ABTS、FRAP三種不同的抗氧化方法結果顯示黑色的畢蕓Ⅱ1和紅花色的畢蕓2015-1抗氧化能力較強，白色的龍12-2614抗氧化能力最弱。這為開發多樣化蕓豆產品提供了參考，在生產功能性食品時，可以傾向于顏色較深的蕓豆作為原料。